Identification de signaux et de mécanismes de tri des protéines de la membrane plasmique dans les cellules épithéliales intestinales

Sorting signals and mechanisms for apical proteins in intestinal epithelial cells

Laboratoire de Génétique et Physiologie du Développement. Case 907, Faculté des Sciences de Luminv, 13 288 Marseille cedex 09. Tel.: 04 91 26 97 44.

Résumé

Dans les cellules épithéliales, la membrane plasmique est divisée en deux domaines qui différent par leur composition biochimique et par leurs fonctions. Le domaine apical des cellules intestinales, par exemple, est responsable de l’absorption des aliments tandis que le domaine basolatéral est impliqué dans des fonctions d’adhérence et de transmission des signaux. Nous étudions les mécanismes responsables de la création et du maintien de tels domaines spécialisés. Notre modèle épithélial est la lignée d’origine colique, Caco-2, et nous analysons le tri et le transport du récepteur humain des neurotrophines (p75NTR) dans ces cellules. Après biosynthèse, le p75NTR est transporté à la membrane basolatérale, puis par transcytose, à la membrane apicale où il s’accumule. Cette localisation apicale dépend de la présence d’un ancrage membranaire et d’une région riche en sites de O-glycosylation près de la membrane.

Parmi les mécanismes potentiellement impliqués dans le tri des protéines de la membrane apicale, nous avons étudié le rôle des microdomaines membranaires formés de lipides et de protéines. Ces microdomaines sont enrichis en protéines ancrées par un glycosylphosphatidyl inositol (GPI), en glycosphingolipides, en cholestérol et en certaines protéines transmembranaires apicales comme la saccharase-isomaltase (SI). Cette composition rappelle celle des structures de la membrane plasmique connues sous le nom de cavéoles et qui contiennent également de la cavéoline 1. Nous avons exprimé dans les cellules Caco-2 la cavéoline 1 et la cavéoline 2, afin de comprendre leur rôle dans la formation des microdomaines et des cavéoles. L’expression de la cavéoline 1 dans les cellules Caco-2, qui ne l’expriment pas, entraîne l’apparition de structures morphologiquement identiques à des cavéoles, ce qui indique que la cavéoline 1 est nécessaire pour la formation de ces structures. L’expression de la cavéoline 2, qui est localisée dans l’appareil de Golgi, n’a pas d’effet sur l’apparition de cavéoles. Son expression cependant augmente la quantité de SI incorporée dans les microdomaines membranaires, ce qui suggère un rôle dans le tri des protéines vers la membrane apicale.

Le contrôle du site de fusion des vésicules de transport formées dans l’appareil de golgi et destinées à la membrane apicale est l’ultime étape de tri. Pour identifier des protéines impliquées dans cette étape, nous avons cloné et caractérisé deux protéines de la famille des SNAREs, la syntaxine 3 et SNAP-23. La syntaxine 3 est localisée à la membrane apicale et forme un complexe avec SNAP-23 qui, elle, n’est pas polarisée. La surexpression de la syntaxine 3 dans les cellules Caco-2 entraîne un ralentissement du transport de la SI vers la membrane apicale, sans affecter le transport vers la membrane basolatérale. Ces résultats indiquent que le complexe syntaxine 3/SNAP-23 est impliqué dans la régulation du transport vers la membrane apicale dans les cellules intestinales.

Abstract

In epithelial cells the plasma membrane is divided into domains that are biochemically and functionally different. In intestinal cells for example the apical domain is facing the intestinal lumen and is involved in the uptake of nutriments while the basolateral domain is mediating cell-cell adhesion and signalisation. We are interested in deciphering the mechanisms underlying the creation and maintenance of such specialized domains. As an epithelial model we have used the intestinal cell line Caco-2 and we have studied the transport and sorting of the human neurotrophin receptor (p75 NTR) in these cells. Newly synthesized p75 NTR is first transported to the basolateral membrane and then is accumulated on the apical membrane after transcytosis. This final apical localization is controlled by the presence of a membrane anchor and a cluster of O-glycosylation sites located in the part of the ectodomain close to the membrane. Among the mechanisms likely to be involved in the sorting of apical components we have looked for a role of lipid-protein microdomain formation in the Golgi apparatus. These membrane microdomains are highly enriched in glycosylphosphatidyl inositol (GPI) anchored proteins, glycosphingolipids and apical proteins such as sucrase isomaltase (SI). Such a composition is also found for endocytic structures called caveolae which are made of caveolin 1. We have expressed caveolin 1 in Caco- 2 cells which do not express it and also caveolin 2, a related protein of unknown function. Expression of caveolin 1 led to formation of caveolae indicating that this protein is necessary for caveolae formation while caveolin 2 is restricted to the Golgi apparatus and has no effect on caveolae formation. However Caveolin 2 increased the amount of SI incorporated in microdomains suggesting a role in recruitment into the apical pathway. The choice for a site of fusion for transport vesicles is the last step of control during exocytosis. To identify proteins involved in that step we have cloned and characterized two members of the t-SNARE family, namely syntaxin 3 and SNAP23. Syntaxin 3 is present on the apical membrane and forms a complex with SNAP23 which is also localized on the basolateral membrane where it forms a complex with syntaxin 4. Overexpression of syntaxin 3 in Caco-2 led to a decrease of SI exocytosis towards the apical membrane confirming that syntaxin 3 is involved in targeting the fusion of apical transport vesicles to the apical pole of the cells.