Efficacy and limits of genotyping low copy number (LCN) DNA samples by multiplex PCR of STR loci

Efficacité et limites du génotypage d’échantillons d’ADN en petit nombre de copies par PCR (Polymerase Chain Reaction) multiplex de loci STR (Short Tandem Repeats)

Netherlands Forensic Institute (NFI)-Volmerlaan 17, 2288 GD Rijswijk, The Netherlands E-mail : a.kloostennan@nfi.minjus.nl

Abstract

In this study, we have evaluated the efficacy and the validity of the AmpFlSTR® SGM plus™ multiplex PCR typing system when Low Copy Number (LCN) amounts of DNA are processed. The characteristics of SGM plus profiles produced under LCN conditions were studied on the basis of heterozygote balance, between loci balance and stutter proportion based on profiles that were obtained from a variety of mock casework samples. These experiments clearly showed that LCN DNA profiles carry their own characteristic features, which must be taken into account during interpretation. Herewith, we confirmed the data of recent other studies that a comprehensive interpretation strategy is dependent upon multiple replication of the PCR using the same extract together with the proper use of extraction and amplification controls.

The limitations of LCN DNA analysis were further studied in a series of single cell PCR experiments using an amplification regime of 34 PCR cycles. The allele dropout phenomenon was demonstrated to its full extent when single cells were analysed. However, the “consensus profile” which was obtained from separate single cell PCR experiments matched the actual profile of the cell donor. Single cell PCR experiments also showed that a further increase of the number of PCR cycles did not result in enhanced sensitivity and had a highly negative effect on the balance of this multiplex PCR system which hampered correct interpretation of the profile.

Also, the potential of LCN typing in analysing mixtures of DNA was investigated. It was clearly shown that LCN typing had no advantages over 28 cycles amplification in the detection of the minor component of DNA-mixtures.

In addition to the 34 cycles PCR amplification regime, the utility of a new approach that involved reamplification of the 28 cycle SGM plus PCR products with an extra 6 PCR cycles after the addition of fresh AmpliTaq Gold^® DNA Polymerase was investigated. This approach provides the scientist with an extra typing result that enhances the reliability of the consensus profile, which is commonly retrieved from two separate 34 cycle PCR results. Furthermore, the 28 + 6 cycles approach may be used to screen LCN samples for their potential to produce a 34 PCR cycle profile. Finally and as a last resort the 28 + 6 cycles approach can be used in those cases where no further extract from the crime sample is available.

Finally, the potential of LCN typing was demonstrated in typing samples from non-probative and actual casework examples. From a high proportion of samples that failed to demonstrate SGM plus typing results using the standard protocol of 28 cycles, at least partial profiles could be obtained after LCN methods were used. For example, LCN typing was applied in a case where 10-year old samples from bones and teeth that were retrieved from a mass grave had to be identified. This study resulted in the positive identification of a number of victims by comparing the LCN DNA profiles with the profiles from putative relatives. The value of LCN DNA typing was further demonstrated in a strangulation case. The throat of the victim was sampled and only after 34 PCR cycles were we able to reveal that the evidential sample contained a distinct mixture of the victim’s own DNA and the DNA of the defendant.

Résumé

Nous avons évalué l’efficacité et la validité du typage PCR à l’aide du kit commercial AmpFlSTR^®, SGM plus™, lorsque le nombre de copies d’ADN disponible est faible (Low Copy Number = LCN).

Dans les profils SGM+ en conditions LCN, l’équilibre entre allèles d’un locus, l’équilibre entre locus et la proportion d’erreurs ont été comparés à ceux d’échantillons artificiellement mélangés en proportions variées.

Ces expériences ont montré que chaque profil d’ADN LCN comporte ses propres particularités qui doivent être prises en compte lors de l’interprétation. Nous confirmons les données d’études récentes, selon lesquelles une stratégie d’interprétation générale dépend de répétitions multiples des PCR à partir du même extrait, accompagnées de contrôles d’extraction et d’amplification selon les protocoles classiques.

Les limites de l’analyse de l’ADN LCN ont aussi été étudiées dans une série d’expériences sur cellule isolée, avec un régime d’amplification de 34 cycles de PCR. Le phénomène de perte d’allèle s’est alors révélé dans toute son ampleur. Cependant le “profil consensus”, obtenu à partir d’une série d’analyses PCR sur cellules isolées identiques, coïncidait avec le profil réel de la cellule donneuse. Les expériences de PCR sur cellule isolée ont également montré qu’augmenter le nombre de cycles au delà de 34 ne donnait pas une meilleure sensibilité, mais avait un effet négatif important sur l’équilibre du système PCR multiplex, au détriment d’une interprétation correcte du profil.

L’efficacité du typage LCN de mélanges D’ADN a également été étudiée. Au delà de 28 cycles d’amplification, le typage LCN ne permet pas de détecter des composants mineurs dans les mélanges.

À côté du régime d’amplification par 34 cycles de PCR, on a tenté de cerner l’utilité d’une nouvelle approche comportant une réamplification des produits de la SGM à 28 cycles à l’aide de 6 nouveaux cycles effectués après addition d’une nouvelle dose d’ampli-Taq gold^® DNA polymerase. Cette approche fournit un typage supplémentaire qui augmente la fiabilité du profil consensus, par rapport à l’approche habituellement utilisée, qui comporte 2 PCR indépendantes à 34 cycles. De plus la stratégie 28 + 6 cycles peut servir à cribler des échantillons LCN, pour déterminer ceux qui sont susceptibles de fournir un profil lisible par PCR à 34 cycles. Enfin, en dernier ressort, la stratégie 28 + 6 cycles peut être mise en oeuvre dans le cas où un seul échantillon criminel est disponible.

Enfin, le potentiel du typage LCN a été démontré sur des échantillons non probatoires ou des échantillons de cas criminels réels. Dans une proportion élevée d’échantillons qui ne donnaient lieu à aucun résultat SGM Plus avec le protocole standard de 28 cycles, des profils partiels ont pu être obtenus grâce aux méthodes LCN. C’est le cas par exemple d’échantillons osseux et dentaires vieux de dix ans provenant d’une tombe collective. L’étude a permis d’identifier avec certitude un certain nombre de victimes en comparant les profils LCN à des profils de parents présumés. L’intérêt du typage LCN a également été démontré dans un cas de strangulation. L’échantillon prélevé sur la gorge de la victime a révélé clairement, mais seulement après 34 cycles, un mélange de l’ADN de la victime et de l’ADN du coupable présumé.