Allotransplantation in utero et immortalisation d’hépatocytes fœtaux de primates

In utero allotransplantation and immortalization of non-human primate fœtal hépatocytes

¹ INSERM EMI 00-20, Laboratoire « Transfert de gènes dans le foie : applications thérapeutiques »
² Service de chirurgie générale
³ Service d’anatomo-pathologie, Hôpital Antoine-Béclère, 157, rue de la Porte de Trivaux, 92141 Clamart

Résumé

Nous développons des approches précliniques chez le primate comme modèle de thérapie cellulaire pour le traitement de maladies métaboliques hépatiques.

Chez le fœtus, les tissus, dont le foie, sont en expansion, ce qui devrait faciliter la prise de greffe des hépatocytes, et le système immunitaire devient pleinement mature seulement après la naissance. Nous avons défini les conditions d’isolement d’hépatocytes fœtaux de macaques à la fin du 2^ème trimestre de gestation (90-100 jours), ainsi que les conditions de culture, de cryopreservation et de transduction rétrovirale. Nous avons également évalué deux voies d’administration différentes des hépatocytes : la veine ombilicale, qui s’est révélée délétère pour les fœtus, et l’injection intraparenchymateuse qui a été parfaitement tolérée par les animaux. Cette dernière a permis de mettre en évidence la présence d’hépatocytes allogéniques, c’est-à-dire un microchimérisme 9 jours après transplantation. Nous avons également immortalisé des hépatocytes simiens fœtaux en utilisant un vecteur retroviral exprimant grand T de SV40 flanqué de sites lox P. Une lignée cellulaire est maintenant établie depuis 2 ans : elle n’est pas tumorigène après injection sous-cutanée à des souris nude et expriment des marqueurs caractéristiques d’hépatoblastes bipotents, précurseurs des hépatocytes et des cellules des voies biliaires. Après transplantation orthotopique via la veine porte chez des souris nude, ces cellules exprimaient l’albumine jusqu’au moment du sacrifice des animaux (17 jours). Les prochaines étapes seront la mise au point des conditions de transplantation d’hépatocytes transduits primaires et/ou immortalisés chez des fœtus plus jeunes (60 jours de gestation) et chez le macaque nouveau-né.

Abstract

We are developing cell therapy approaches on nonhuman primates as a preclinical model for the treatment of hepatic metabolic diseases.

In foetuses, the tissues, including liver, are in expansion, which should facilitate hepatocytes engraftment, and the immune system becomes fully mature only after birth. We have set out conditions for isolation of fetal hepatocytes from macaca mulatta at the end of the 2nd trimester of gestation (90- 100 days), their cryopreservation and retroviral transduction. Two different routes of administration of hepatocytes were evaluated : the umbilical vein which was deleterious for the foetuses, and the intra- parenchymous injection which was well tolerated by the animals. Administration of hepatocytes into the hepatic parenchyma resulted in microchimerism and allogenic cells were visualized 9 days after transplantation. Another approach has been to immortalize simian fœtal hepatocytes using a retroviral vector expressing SV40 Large T flanked by lox sites. A cell line has been established for 2 years, which is not tumorigenic when injected subcutaneously into nude mice and display caracteristics of bipotent hepato- blasts, precursors of hepatocytes and biliary cells. After orthotopic transplantation into nude mice via the portal vein, these cells expressed albumin until the sacrifice of the animals (17 days). The next steps will be to define conditions for transplantation of retrovi- rally transduced fetal primary and/or immortalized hepatocytes into young foetuses (60 days of gestation) and post-natally.