Oscillations calciques induites par le lindane chez les macrophages péritonéaux de souris : Contrôle par l’état de maturité du macrophage

Cytosolic calcium oscillations induced by lindane in peritoneal macrophages of mouse: control by cell maturation stage

¹ Laboratoire de Toxicologie et Sécurité Alimentaire, ENSAT, Avenue de l'Agrobiopole Auzeville-Tolosane 31326 Castanet-Tolosan Cedex, France.
² Laboratoire UPRES-EA-2405, Macrophages, médiateurs de l'inflammation et interactions cellulaires, Hopital Rangueil, 31054 Toulouse, France.
³ Laboratoire de Biophysique Cellulaire, IPBS-CNRS, 205, route de Narbonne, 31077 Toulouse cedex 4, France.
⁴ Tél. : (33)(0) 5.61.17.58.10. Fax : (33)(0) 5.61.17.59.97. E-mail : brunogabriel@ipbs.fr.

Résumé

Les variations de la concentration cytosolique en ions calcium libres ([Ca²⁺]_i) ont été analysées après stimulation par le Lindane (γ-hexachlorocyclohexane ou γ-HCCH) de macrophages péritonéaux extraits de souris et chargés avec la sonde calcique Fluo-3. Ces études ont été réalisées en vidéomicroscopie, à la fois au niveau de la population de macrophages, et au niveau de la cellule isolée. Le but était de caractériser le rôle de l’influx de calcium extracellulaire initial sur la cinétique des changements calciques induits par le γ-HCCH, et cela en fonction du stade de maturation du macrophage. Après exposition au γ-HCCH en présence de 600 µM calcium, l’observation des changements de [Ca²⁺]_i au niveau de la cellule unique montre que : 1) les variations de [Ca²⁺]_i sont des oscillations asynchrones mais de même fréquence (1,7 min^-1), et 2) les variations calciques observées ne sont pas de la même ampleur dans tous les macrophages. Cette hétérogénéité de réponse peut être corrélée à une répartition de la population macrophagique totale en deux sous-populations de taille différente (10,1 +/- 0,44 et 11,45 +/- 0,43 µm). La différence de taille des macrophages peut être associée à une hétérogénéité phénotypique en relation avec le stade de maturation de la cellule. La mesure de l’activité peroxydasique montre que les petits macrophages sont des macrophages exsudés alors que les gros sont des macrophages résidents. En présence de 100 pM Ca2+ externe, le γ-HCCH induit une entrée de calcium dans les deux sous-populations mais des oscillations ne sont observées que dans les macrophages exsudés. Dans le cas des macrophages résidents, seul l’influx calcique initial est observé puis la [Ca²⁺]_i décroît jusqu’au niveau de base. L’inhibition des oscillations calciques par de faibles concentrations en calcium externe ([Ca²⁺]_ext) ainsi que par le chlorure de lanthane (LaCl₃) montre l’importance de l’influx calcique initial dans le déclenchement des oscillations. Cet influx calcique induit une production d’inositol triphosphate (InsP3) dans le macrophage. Le maintien des oscillations calciques est associé à la mobilisation du calcium des stocks intracellulaires via la voie des InsP3, comme le montre leur inhibition par la néomycine et le 8-(diéthylamino) octyl 3,4,5-trime-thoxybenzoate (TMB-8). L’exposition de macrophages au lindane induit une brève entrée de calcium externe qui déclenche alors une activité de la phospholipase C et le déclenchement d’oscillations calciques. Cependant, nous montrons que des réponses cellulaires différentes sont observées en fonction du stade de maturité du macrophage péritonéal de souris, et de la concentration en calcium externe.

Abstract

Mouse resident peritoneal macrophages loaded with Fluo-3 were examined for changes in cytosolic calcium concentration ([Ca²⁺]_i) after stimulation with γ-hexachlorocyclohexane (Lindane or γ-HCCH). These studies, realized on macrophage populations, or single cells, by digital imaging microscopy, sought to determine the role of calcium influx on cyclical changes according to maturation stages of macrophages. Single cell analysis of [Ca²⁺]_i changes in macrophages, after γ-HCCH exposure in 600 µM extracellular calcium, demonstrated that: 1) these [Ca²⁺]_i variations were asynchronous oscillations with the same frequency (1.7 min ^-1), and 2) these [Ca²⁺]_i variations in macrophages were not at the same [Ca²⁺]_i level. This heterogeneity could be correlated to a cell size partition of the macrophage population (10.1 +/- 0.44 and 11.45 +/- 0.43 µm). In the presence of 100 pM calcium, γ-HCCH induced a calcium influx into the two subpopulations, but the calcium oscillations appeared only in small macrophages. In the largest ones, [Ca²⁺]_i slowly decreased back down to the basal level. The cell size variation could be correlated to a phenotypic heterogeneity, linked to the differenciation stage of the cell. Peroxydase activity showed that small macrophages were in fact exudate macrophages and the largest ones were resident macrophages. Inhibition of the oscillatory patterns by a decrease in the extracellular calcium concentration ([Ca²⁺]_ext) or by lanthanum chloride (LaCI3) addition is indicative of the important role of calcium influx in the triggering of oscillations. The calcium influx was transient and induced inositol phosphate (InsP3) production in macrophages. The maintainance of these calcium oscillations depended on calcium mobilization from intracellular calcium stores by InsP3, since neomycin and 8-(diethylamino) octyl 3,4,5-trime- thoxybenzoate (TMB-8) abolished the oscillations. γ-HCCH induced a transient calcium entry which triggered phospholipase C activation and the associated [Ca²⁺]_i oscillations. However, we showed that differences in cell responses were observed in relationship with the differentiation stage of the mouse peritoneal macrophages, and with the extracellular calcium concentration.