Principe des tests haut débit de l’activité enhancer. (A) Aperçu de la méthode MPRA (Massively Parallel Reporter Assay). Les séquences testées (variants, sauvages, etc.) sont généralement synthétisées in silico par synthèse massive d’oligonucléotides avec des codes-barres uniques (Tag) puis clonées dans le plasmide. Les tags peuvent être synthétisés en même temps que les séquences ou ajoutés après synthèse par amplification PCR (Polymerase Chain Reaction). Un promoteur basal et un ORF (Open Reading Frame) de gène rapporteur sont insérés entre l’élément testé et les codes-barres. La banque de gènes rapporteurs est ensuite transfectée dans des cellules en culture. Par la suite, l’ARNm est isolé et l’ADNc est synthétisé. Les codes-barres sont séquencés avant (banque plasmidique pour normalisation) et après transfection. La différence dans l’enrichissement de chaque code-barre est proportionnelle à l’activité enhancer de la séquence testée. Dans le cas de l’ajout de codes-barres après la synthèse, une étape de séquençage supplémentaire est nécessaire à la première étape du clonage. (B) Aperçu du séquençage de l’auto-transcription des régions régulatrices actives (STARR-Seq). Une banque de chromosomes bactériens artificiels (BAC) ou génomiques est clonée dans le plasmide rapporteur en aval de l’ORF et en amont du site de polyadénylation (pAS). Par ailleurs, les régions d’intérêt peuvent être enrichies par une approche de capture. La banque de gènes rapporteurs est transfectée dans des cellules en culture. Par la suite, l’ARNm est isolé et l’ADNc est synthétisé. Les régions clonées sont séquencées à partir de la banque de plasmides (contrôle) et de l’ADNc. Les différences d’enrichissement par rapport au contrôle sont proportionnelles à l’activité de l’enhancer. Dans les deux cas, l’effet de l’enhancer sur le promoteur basal est indiqué par une flèche.