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Accueil Tous les numéros Volume 211 / Numéro 4 (2017) Biologie Aujourd'hui, 211 4 (2017) 271-280 Full HTML
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Biologie Aujourd'hui
Volume 211, Numéro 4, 2017
Page(s) 271 - 280
Section CRISPR : d’un système immunitaire procaryote à une révolution technologique (Journée Claude Bernard)
DOI https://doi.org/10.1051/jbio/2018015
Publié en ligne 29 juin 2018

© Société de Biologie, 2018

Introduction

L’expression des gènes est rigoureusement contrôlée par une combinaison de promoteurs et de régions régulatrices distales connues sous le nom d’enhancers (Kim & Shiekhattar, 2015 ; Vernimmen & Bickmore, 2015). Parallèlement avec la prise de conscience croissante du rôle important des enhancers dans le développement normal et pathologique, il s’est développé un fort intérêt scientifique pour identifier et caractériser ces éléments. Or, cette tâche est difficile car un enhancer n’est pas nécessairement placé directement à côté du gène qu’il régule. Les enhancers potentiels peuvent être identifiés sur l’ensemble du génome à partir des régions ouvertes de la chromatine capturées à partir d’expériences de DNase, ATAC-seq ou encore à partir de signatures chromatiniennes (H3K4me1, H3K27ac) pour la cartographie des enhancers potentiellement actifs (Chatterjee & Ahituv, 2017). Bien qu’informatives, ces approches ne fournissent pas de preuves directes de la fonction enhancer d’une région. Elles ne permettent pas non plus d’identifier précisément les séquences responsables de l’activité enhancer. Par conséquent, il est crucial de vérifier la fonction enhancer de ces régions génomiques dans les cellules.

Ces dernières années, des techniques de pointe variées intégrant du séquençage haut débit dans des tests de type « gène rapporteur » ont permis de mesurer de manière directe et quantitative l’activité enhancer de plusieurs milliers de régions génomiques. Plus récemment, l’avènement des approches liées au CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) permet d’établir à grande échelle la pertinence de la fonction enhancer dans le contexte endogène. Cette revue résume les essais mis au point pour tester l’activité des enhancers à l’échelle du génome, et pointe leurs limites, ainsi que les principales découvertes recueillies à l’aide des techniques présentées.

Principe des tests de gènes rapporteurs à haut débit

Les tests « gène rapporteur » épisomaux ont été largement utilisés pour caractériser les régions régulatrices potentielles. Plusieurs stratégies à haut débit ont été mises au point, permettant une analyse simultanée de centaines de milliers de plasmides rapporteurs. Elles ont fait l’objet de plusieurs revues exhaustives (par ex. Dailey, 2015 ; Inoue & Ahituv, 2015 ; White, 2015). Ces méthodes conçues pour tester l’activité des enhancers ou des promoteurs peuvent être qualitatives (généralement grâce au tri cellulaire) ou quantitatives (basées sur les analyses de RNA-seq). Nous nous intéresserons ici aux méthodes quantitatives récentes visant à caractériser les enhancers. Deux approches en particulier ont été largement utilisées au cours de ces dernières années (Figure 1, Tableau 1) : l’analyse à haut débit en parallèle de gènes rapporteurs Massively Parallel Reporter Assays (MPRA) et le séquençage de régions régulatrices auto-transcrites (STARR-seq).

La méthode MPRA consiste en la génération d’une banque de plasmides rapporteurs contenant les séquences d’ADN d’intérêt généralement clonées en amont d’un promoteur basal. Les régions d’intérêt sont préalablement produites grâce à la technologie de synthèse massive d’ADN sur micropuce et amplifiées par PCR à l’aide d’oligonucléotides contenant des séquences tags ou codes-barres uniques (placées dans les 3′ UTR du gène rapporteur). Pour augmenter la sensibilité et la reproductibilité, plusieurs codes-barres peuvent être ajoutés à n’importe quelle séquence. La banque de rapporteurs est ensuite transfectée dans les lignées cellulaires pertinentes et le séquençage ARN des codes barre est réalisé, fournissant ainsi une lecture quantitative de l’activité régulatrice des régions testées (Figure 1A).

Le MPRA a été utilisé pour étudier un certain nombre de questions biologiques. À l’origine, il a été conçu pour examiner les composants fonctionnels d’enhancers précédemment identifiés à la résolution d’un seul nucléotide (Melnikov et al., 2012 ; Patwardhan et al., 2012). Par la suite, une approche similaire (appelée CRE-seq) a été utilisée pour tester fonctionnellement environ 2000 régions prédites par ENCODE comme étant des enhancers, des enhancers faibles ou des éléments réprimés (Kwasnieski et al., 2014) et des enhancers synthétiques afin de modéliser des règles grammaticales des séquences régulatrices (Smith et al., 2013 ; Nguyen et al., 2016). Le MPRA peut également être utilisé pour évaluer systématiquement la pertinence des motifs de régulation prédits à l’intérieur d’enhancers. Kheradpour et al. ont en effet testé environ 2000 enhancers putatifs ainsi que des enhancers synthétiques contenant des variants de motifs ciblés par certains facteurs de transcription (FT) (Kheradpour et al., 2013). Par la suite, le même laboratoire a mis au point une approche MPRA à haute résolution (également appelée Sharpr-MPRA) qui a permis de cartographier à l’échelle du génome les nucléotides activateurs et répresseurs dans les régions régulatrices (Ernst et al., 2016). Grâce à la synthèse de constructions MPRA chevauchantes à large couverture, ces auteurs sont parvenus à déduire les effets régulateurs de nucléotides ayant des propriétés soit activatrices soit répressives (Ernst et al., 2016 ; Nguyen et al., 2016). Enfin, le MPRA peut être utilisé afin de tester l’impact de SNP (Single-Nucleotide Polymorphisms) et identifier les variants régulateurs fonctionnels associés à des caractères ou des maladies humaines. Deux études récentes du Broad Institute ont fourni la preuve de principe de telles approches. Tewhey et al. ont utilisé une version améliorée du MPRA pour analyser des milliers d’eQTL (expression Quantitative Trait Loci) et identifier les allèles qui ont un impact sur l’expression génique dans des lignées cellulaires lymphoblastiques (Tewhey et al., 2016). Ulirsch et al. ont utilisé le MPRA pour tester 2756 variants associés à 75 loci d’association pangénomique (GWAS) impliqués dans les caractères érythrocytaires (Ulirsch et al., 2016). Dans les deux cas, la pertinence des résultats du MPRA a été confirmée par l’ingénierie génétique CRISPR. Il est intéressant de noter que certains de ces variants régulateurs identifiés ne se situaient pas dans des motifs connus, suggérant ainsi qu’ils influencent la structure de l’ADN plutôt que la liaison des FT (Ulirsch et al., 2016).

Alexander Stark et ses collègues ont introduit une nouvelle méthode innovante appelée STARR-seq (Arnold et al., 2013) (pour revue, voir Muerdter et al., 2015). Le STARR-seq a pour but d’identifier et de quantifier les enhancers transcriptionnels directement en se basant sur leur activité dans le génome entier (Figure 1B). En bref, un grand nombre de fragments d’ADN de provenances arbitraires sont clonés en aval dans le 3′ UTR d’un gène rapporteur (GFP). Une fois dans un contexte cellulaire, les enhancers actifs activeront le promoteur en amont et se transcriront eux-mêmes, générant des transcrits rapporteurs parmi les ARN cellulaires. Ainsi, chaque transcrit contient le gène rapporteur et son « code-barre ». Ces transcrits peuvent être isolés séparément par PCR ciblée et éventuellement détectés par séquençage haut débit. De cette façon, l’activité de millions d’enhancers putatifs peut être mesurée simultanément, sans être affectée par l’emplacement des séquences candidates et leur orientation. Le principal avantage par rapport au MPRA classique est que la séquence testée elle-même est utilisée comme un « code-barre », simplifiant considérablement l’ensemble de la procédure de quantification de l’activité des enhancers. Le laboratoire d’Alexander Stark a utilisé les approches STARR-seq pour poser plusieurs questions mécanistiques de base sur la biologie des enhancers chez la drosophile et notamment (i) l’identification et la caractérisation des enhancers spécifiques d’un type cellulaire (Arnold et al., 2013 ; Yáñez-Cuna et al., 2014) et hormono-sensibles (Shlyueva et al., 2014), (ii) l’impact de la variation de séquence cis-régulatrice sur l’activité et l’évolution des enhancers (Arnold et al., 2014) et (iii) la dissection des bases de spécificité des enhancers sur différents types de promoteurs (de gènes développementaux versus gènes constitutifs) (Zabidi et al., 2015).

Le STARR-seq a été appliqué aux cellules humaines en utilisant les BAC (Bacterial Artificial Chromosomes) (Arnold et al., 2013). Cependant, avec la complexité et la taille des génomes de mammifères, cette technique n’est pas facile à mettre en œuvre. La préparation de banques représentatives est un défi et requiert une très grande profondeur de séquençage. Pour éviter ce problème, nous avons développé une approche basée sur la capture de séquences (appelée CapSTARR-seq) pour évaluer un sous-ensemble de Sites Hypersensibles à la DNase (DHS) dans des thymocytes en développement chez la souris (Vanhille et al., 2015). Les régions d’intérêt sont capturées à l’aide de puces à ADN synthétisées à façon et clonées dans le vecteur STARR-seq, ce qui permet une quantification précise et économiquement rentable de l’activité des enhancers chez les mammifères. Des approches similaires ont été publiées par d’autres laboratoires, y compris la capture de variants génomiques naturels (Vockley et al., 2015) et de séquences DHS du système nerveux central en utilisant une approche de capture avec des oligo-appâts (Shen et al., 2016). Alternativement, il serait possible de cloner directement les régions de chromatine ouvertes (Murtha et al., 2014 ; Barakat et al., 2017 ; Wang et al., 2017). En effet, récemment, deux études indépendantes ont réussi à réaliser des expériences de STARR-seq sur le génome humain entier (Liu et al., 2017 ; Muerdter et al., 2018).

thumbnail Figure 1

Principe des tests haut débit de l’activité enhancer. (A) Aperçu de la méthode MPRA (Massively Parallel Reporter Assay). Les séquences testées (variants, sauvages, etc.) sont généralement synthétisées in silico par synthèse massive d’oligonucléotides avec des codes-barres uniques (Tag) puis clonées dans le plasmide. Les tags peuvent être synthétisés en même temps que les séquences ou ajoutés après synthèse par amplification PCR (Polymerase Chain Reaction). Un promoteur basal et un ORF (Open Reading Frame) de gène rapporteur sont insérés entre l’élément testé et les codes-barres. La banque de gènes rapporteurs est ensuite transfectée dans des cellules en culture. Par la suite, l’ARNm est isolé et l’ADNc est synthétisé. Les codes-barres sont séquencés avant (banque plasmidique pour normalisation) et après transfection. La différence dans l’enrichissement de chaque code-barre est proportionnelle à l’activité enhancer de la séquence testée. Dans le cas de l’ajout de codes-barres après la synthèse, une étape de séquençage supplémentaire est nécessaire à la première étape du clonage. (B) Aperçu du séquençage de l’auto-transcription des régions régulatrices actives (STARR-Seq). Une banque de chromosomes bactériens artificiels (BAC) ou génomiques est clonée dans le plasmide rapporteur en aval de l’ORF et en amont du site de polyadénylation (pAS). Par ailleurs, les régions d’intérêt peuvent être enrichies par une approche de capture. La banque de gènes rapporteurs est transfectée dans des cellules en culture. Par la suite, l’ARNm est isolé et l’ADNc est synthétisé. Les régions clonées sont séquencées à partir de la banque de plasmides (contrôle) et de l’ADNc. Les différences d’enrichissement par rapport au contrôle sont proportionnelles à l’activité de l’enhancer. Dans les deux cas, l’effet de l’enhancer sur le promoteur basal est indiqué par une flèche.
Tableau 1

Exemples de tests fonctionnels enhancers à grande échelle chez les mammifères.

Mise en garde concernant les essais de gènes rapporteurs à haut débit

Les sources d’ADN utilisées sont un problème potentiel pour les tests de gènes rapporteurs à haut débit. La plupart des approches MPRA ont fait appel à de la synthèse massive d’oligonucléotides (Figure 1A), ce qui permet de définir avec précision les régions testées et de modifier à façon les séquences sous-jacentes. Toutefois, cette approche comporte actuellement deux limites. D’une part, la taille du fragment testé est limitée à ∼200 bp (en incluant les adaptateurs), ce qui peut empêcher de tester des régions régulatrices complètes. De plus, le nombre d’oligonucléotides qui peut être synthétisé est limité (actuellement 100 000 au maximum). Ces contraintes devraient être surmontées dans un proche avenir grâce à l’amélioration des technologies de synthèse des oligonucléotides. Un autre biais concerne le fait que la transfection des plasmides dans les cellules de mammifères induit l’activation d’une réponse interféron de type I pouvant fausser l’interprétation des résultats (Muerdter et al., 2018).

Dans l’approche STARR-seq, les fragments d’ADN sont clonés dans la région transcrite (Figure 1B). Leurs séquences fournissent alors directement les informations sur l’activité de l’enhancer. Cependant, cela introduit également une source d’artefact potentiel car certaines séquences peuvent influencer la stabilité du transcrit plutôt que l’activation de la transcription. Ce biais éventuel pourrait être évité en comparant les résultats des régions testées dans les deux orientations permettant ainsi d’éliminer l’effet stabilisant spécifique d’un brin.

Une préoccupation générale au sujet des tests rapporteurs épisomaux est qu’ils peuvent ne pas refléter précisément la fonction des éléments enhancers dans leur contexte endogène. Pour éviter partiellement cet inconvénient, des MPRA lentiviraux (Murtha et al., 2014 ; Inoue et al., 2017) ou associés à de la chromatine d’adénovirus (Nguyen et al., 2016 ; Shen et al., 2016) ont été réalisés. Ces méthodes permettent d’effectuer des tests rapporteurs dans des cellules ou des tissus difficiles à transfecter. Bien sûr, un argument également valable est que les tests de gènes rapporteurs épisomaux permettent l’étude non biaisée de la fonction d’enhancer indépendamment de l’influence de la conformation de la chromatine ou du contexte génomique. Il est intéressant de noter qu’une étude récente a réalisé une comparaison systématique de l’activité enhancer épisomale versus chromosomique en utilisant des versions intégratives et non intégratives d’un test rapporteur lentiviral (Inoue et al., 2017). Bien que le test gène rapporteur chromosomal soit plus prévisible par les modèles épigénomiques et séquentiels, les deux tests étaient relativement bien corrélés. Une autre approche alternative est l’introduction de gènes rapporteurs dans le génome à l’aide de systèmes de transposition (Ruf et al., 2011 ; Akhtar-Zaidi et al., 2012 ; Symmons et al., 2014)). Bien que ces approches n’évaluent pas directement l’activité enhancer, elles permettent de tester l’influence du contexte régulateur de loci endogènes.

Approches fondées sur le CRISPR pour l’évaluation de la fonction enhancer

Comme nous l’avons déjà mentionné, une des limites potentielles des essais de gènes rapporteurs est le fait que les enhancers candidats soient étudiés en dehors de leur contexte génomique endogène, lequel est probablement nécessaire pour leur fonction in vivo. L’avènement des technologies CRISPR permet maintenant de contourner cette restriction (Lo & Qi, 2017 ; Montalbano et al., 2017). Plusieurs études ont effectué une dissection systématique d’enhancers individuels à l’aide de mutagenèses induites par TALEN (Vierstra et al., 2015) ou CRISPR (Canver et al., 2015). Dans le cadre de ces études, une banque d’ARN guide unique ou TALEN, qui couvre des enhancers sélectionnés, a été conçue pour effectuer des analyses saturantes de mutagénèse in situ, en mettant en évidence des séquences ayant un impact positif ou négatif sur la fonction enhancer. L’approche du CRISPR a par la suite été élargie pour évaluer la fonction enhancer dans de grandes régions génomiques entourant des loci d’intérêt (Diao et al., 2016, 2017 ; Rajagopal et al., 2016 ; Sanjana et al., 2016) ou pour identifier des éléments enhancers impliqués dans des voies de régulation génique spécifiques (Korkmaz et al., 2016) (Tableau 1).

La mutagénèse médiée par le CRISPR est limitée par le fait qu’une densité élevée d’ARN guides est nécessaire pour saturer tous les éléments régulateurs possibles et que des mutations spécifiques sont difficiles à mettre en œuvre à l’échelle du génome. Dans certains cas, il peut aussi y avoir un biais en ce qui concerne les régions qui peuvent être ciblées par les ARN guides ou des limitations dues à l’efficacité de la transfection dans certains types de cellules. Alternativement, la Cas9 avec l’activité nucléase désactivée (dCas9) peut être fusionnée à des domaines activateurs ou répresseurs pour modifier précisément l’expression génique des promoteurs et des éléments régulateurs distaux (Hsu et al., 2014). Sur la base de cette propriété, les domaines répresseurs et activateurs fusionnés avec la dCas9 et combinés à un pool d’ARN guides ont été utilisés pour générer du CRISPR d’activation ou d’inactivation (CRISPRi) en ciblant des sites DHS associés à un gène d’intérêt (Klann et al., 2017) ou l’ensemble d’un locus (Fulco et al., 2016). Dans la première étude, un gène rapporteur, introduit à la place des gènes cibles, a été utilisé pour évaluer l’activité des enhancers. Dans la deuxième étude, les critères de sélection se fondaient sur l’avantage ou le désavantage de croissance que procurait le changement d’expression du gène associé à l’enhancer, fournissant ainsi une preuve de concept pour l’identification à l’échelle du génome des régions enhancers fonctionnelles. Une des limites actuelles de ces approches est que la stratégie d’étude est fondée sur des caractéristiques phénotypiques (comme la capacité de croissance cellulaire, les marqueurs du développement, etc…) au lieu d’évaluer directement les niveaux d’expression des gènes régulés. Pour surmonter cette limitation, une nouvelle et puissante méthode a combiné le CRISPRi et le RNA-seq sur cellule unique (Xie et al., 2017) permettant ainsi de relier directement la fonction enhancer et l’effet combinatoire de plusieurs variants de chaque enhancer avec le ou les gènes cibles. Bien que ces approches aient été utilisées jusqu’à présent pour étudier des zones génomiques restreintes, elles seront vraisemblablement mises en œuvre dans l’avenir pour une véritable dissection des éléments enhancers à l’échelle du génome.

Quelques résultats pertinents

L’un des intérêts des tests enhancer à haut débit est la possibilité d’explorer la fonction d’enhancer sans notions préconçues, menant ainsi à de nouvelles découvertes imprévues. Une observation commune de plusieurs études est que de nombreuses régions prédites pour avoir une fonction enhancer ne présentent pas d’activité rapporteur (Arnold et al., 2013 ; Kheradpour et al., 2013 ; Kwasnieski et al., 2014 ; Vanhille et al., 2015 ; Ernst et al., 2016). Par exemple seulement 26 % des enhancers prédits, basés sur les signatures de chromatine dans les cellules K562, présentaient une activité enhancer dans les tests rapporteurs effectués sur la même lignée (Kwasnieski et al., 2014). Ceci suggère qu’en plus des modifications d’histones, des spécificités séquentielles additionnelles, comme des sites de liaison aux facteurs de transcription, sont des déterminants essentiels de l’activité cis-régulatrice. En effet, la concentration de sites ou de motifs liant des facteurs de transcription est hautement prédictive d’une forte activité enhancer (Dogan et al., 2015 ; Vanhille et al., 2015 ; Ernst et al., 2016). Par ailleurs, cela pourrait également indiquer que toutes les séquences requises ne sont pas présentes dans les régions testées ou que les contextes des promoteurs endogènes sont essentiels à l’activité enhancer. Enfin, il est également possible que certaines régions de chromatine ouvertes, bien que contribuant à la régulation transcriptionnelle, aient des fonctions indépendantes des enhancers (Bevington et al., 2017) ou n’aient pas les fonctions classiques des enhancers (Engreitz et al., 2016).

Les résultats les plus surprenants des tests des enhancers fonctionnels proviennent peut-être de l’observation selon laquelle beaucoup de promoteurs affichent une activité enhancer (Arnold et al., 2013 ; Zabidi et al., 2015 ; Nguyen et al., 2016 ; Dao et al., 2017 ; Medina-Rivera et al., 2018 ; Muerdter et al., 2018). La définition originale des enhancers implique la capacité à activer l’expression de gènes à distance, tandis que les promoteurs impliquent la capacité d’induire une expression de gènes au niveau local. Toutefois, cette dichotomie fondamentale des éléments cis-régulateurs a été contestée par la mise en évidence de grandes similitudes entre les promoteurs et les enhancers, telles que les caractéristiques de séquences d’ADN, les marques de chromatine, le recrutement de la polymérase II et la transcription bidirectionnelle (Andersson, 2015). Par exemple, la modification de l’histone généralement observée dans les régions de promoteurs, H3K4me3, a également été associée à des enhancers (Koch et al., 2011 ; Pekowska et al., 2011 ; Core et al., 2014). L’évaluation de l’activité des enhancers par CapSTARR-seq a montré que les enhancers distaux du site d’initiation de la transcription (Transcription Start Site, TSS) sont effectivement associés à un enrichissement en H3K4me3 dans les loci endogènes (Vanhille et al., 2015). Plusieurs études ont également suggéré que certains promoteurs pourraient avoir des fonctions enhancers (Medina-Rivera et al., 2018). Plusieurs études indépendantes basées sur les tests gènes rapporteurs à haut débit ont notamment fait état d’une activité enhancer étendue à partir des régions proximales aux TSS. En appliquant la technique du STARR-seq, Zabidi et al. (2015) ont passé au crible le génome de la drosophile à l’aide de différents promoteurs obtenus à partir de gènes de ménage, de gènes impliqués dans le développement et de gènes spécifiques de type cellulaire. Ils ont découvert que les promoteurs des gènes constitutifs étaient principalement régulés par des promoteurs proximaux à activité enhancer tandis que les promoteurs des gènes développementaux et des gènes tissu-spécifiques ont quant à eux besoin d’enhancers distaux. Ernst et al. ont montré dans les lignées cellulaires humaines que les enhancers actifs étaient enrichis en sites DNaseI qui chevauchent les TSS (Ernst et al., 2016). Nguyen et al. (2016) ont réalisé une comparaison fonctionnelle d’une série de promoteurs et enhancers issus de cellules neuronales de souris en utilisant une approche MPRA intégrative. Il est intéressant de noter que les promoteurs de gènes ont généré une activité enhancer similaire aux régions régulatrices distales. Dans une étude récente, nous avons constaté que 2 à 3 % de tous les promoteurs humains présentaient une activité enhancer dans une lignée cellulaire donnée (Dao et al., 2017). Comparé aux promoteurs et aux enhancers distaux classiques, ces promoteurs-enhancers se chevauchaient, présentaient des caractéristiques génomiques et épigénomiques distinctes et étaient associés à des gènes constitutifs et de réponse au stress. Les délétions génomiques par CRISPR ont démontré que plusieurs promoteurs, avec une activité enhancer dans leur contexte naturel, sont en effet impliqués dans la cis-régulation de l’expression de gènes distaux et fonctionnent en outre comme de véritable enhancers (Dao et al., 2017). De plus, des variations génétiques humaines au sein de ce type de promoteur ont été associées à un effet important sur l’expression des gènes distaux. Parallèlement, une autre étude utilisant la manipulation génétique par CRISPR/Cas9 des régions promotrices a fait état d’une cis-régulation distale fréquente par des loci associés à des promoteurs d’ARNnc et dans une moindre mesure par des loci avec des gènes codants (Engreitz et al., 2016). Enfin, deux études récentes qui ont effectué des cribles d’éléments cis-régulateurs par des approches CRISPR/Cas9 ont montré que l’expression de certains gènes est contrôlée par des promoteurs de gènes distaux (Rajagopal et al., 2016 ; Diao et al., 2017). Dans l’ensemble, ces résultats ouvrent une possibilité intéressante : les variants associés à des caractères ou des maladies situées dans un sous-ensemble de promoteurs pourraient directement impacter l’expression de gènes distaux (Figure 2).

thumbnail Figure 2

Étude d’éléments cis-régulateurs par CRISPR/Cas9. La technologie CRISPR/Cas9 permet d’éditer l’ADN génomique de manière ciblée grâce à un petit fragment d’ARN guide. L’endonucléase Cas9 reconnaît le complexe ARN guide/ADN et coupe le double brin d’ADN, déclenchant ainsi dans la cellule les systèmes de réparation de l’ADN. L’utilisation d’une Cas9 ayant perdu son activité d’endonucléase (dCas9) permet de cibler l’ADN sans le couper. Ainsi, la technologie CRISPR peut être utilisée pour étudier les séquences régulatrices dans leur contexte naturel par délétion d’une séquence régulatrice via l’utilisation de deux ARN guides et réparation de l’ADN par jonction d’extrémités non homologues (I) ou par remplacement d’une séquence par sa copie mutée ajoutée grâce au système de réparation par recombinaison homologue (II), modifications épigénétiques de l’ADN grâce à un modulateur épigénétique (activateur ou répresseur) couplé à la dCas9 (III), identification d’éléments régulateurs potentiels d’un gène d’intérêt en passant au crible les régions génomiques voisines par CRISPR/(d)Cas9 (IV).

Conclusions

La mise en œuvre de tests de gènes rapporteurs à haut débit et de criblages basés sur le CRISPR permet la validation expérimentale de l’activité des enhancers dans différents types de cellules et de contextes cellulaires. Ces essais sont maintenant suffisamment robustes et sensibles pour être largement utilisés par les chercheurs qui s’intéressent à la régulation des gènes. Ces approches ont également donné lieu à des découvertes imprévues, comme le rôle de certains promoteurs en tant que régulateurs de type enhancer. L’une des principales limites de ces approches réside dans le fait qu’elles ne fournissent pas d’informations directes sur la découverte des gènes ciblés par les enhancers. Par conséquent, la combinaison de tests d’enhancers avec les méthodologies 3C récemment développées, telles que le 4C-seq, Hi-C ou capture Hi-C (Sati & Cavalli, 2017), devrait considérablement faciliter l’assignation des enhancers découverts à leurs gènes cibles présumés. Enfin, avec la baisse attendue du coût du séquençage et de la synthèse massive d’oligonucléotides, il sera possible de tester systématiquement l’impact des variants dans les régions régulatrices dans différents contextes pathologiques et développementaux.

Remerciements

Le travail au sein du laboratoire TAGC est soutenu par des financements récurrents de la part de l’Inserm et d’Aix-Marseille Université (AMU). Le projet menant à cette publication a reçu des subventions de l’ARC (PJA 20151203149), du Plan Cancer (P036496), de l’Initiative d’Excellence AMU (A*Midex), du programme français « Investissements d’Avenir » et de la Ligue Contre le Cancer (Équipe Labellisée). A.E. et D.S.G. perçoivent respectivement une bourse du Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche d’une part, et du Conacyt (Mexique), d’autre part.

Références

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Citation de l’article : España, A.P., Santiago-Algarra, D., Pradel, L., et Spicuglia, S. (2017). Approches haut débit pour l’étude des séquences cis-régulatrices. Biologie Aujourd'hui, 211, 271-280

Liste des tableaux

Tableau 1

Exemples de tests fonctionnels enhancers à grande échelle chez les mammifères.

Dans le texte

Liste des figures

thumbnail Figure 1

Principe des tests haut débit de l’activité enhancer. (A) Aperçu de la méthode MPRA (Massively Parallel Reporter Assay). Les séquences testées (variants, sauvages, etc.) sont généralement synthétisées in silico par synthèse massive d’oligonucléotides avec des codes-barres uniques (Tag) puis clonées dans le plasmide. Les tags peuvent être synthétisés en même temps que les séquences ou ajoutés après synthèse par amplification PCR (Polymerase Chain Reaction). Un promoteur basal et un ORF (Open Reading Frame) de gène rapporteur sont insérés entre l’élément testé et les codes-barres. La banque de gènes rapporteurs est ensuite transfectée dans des cellules en culture. Par la suite, l’ARNm est isolé et l’ADNc est synthétisé. Les codes-barres sont séquencés avant (banque plasmidique pour normalisation) et après transfection. La différence dans l’enrichissement de chaque code-barre est proportionnelle à l’activité enhancer de la séquence testée. Dans le cas de l’ajout de codes-barres après la synthèse, une étape de séquençage supplémentaire est nécessaire à la première étape du clonage. (B) Aperçu du séquençage de l’auto-transcription des régions régulatrices actives (STARR-Seq). Une banque de chromosomes bactériens artificiels (BAC) ou génomiques est clonée dans le plasmide rapporteur en aval de l’ORF et en amont du site de polyadénylation (pAS). Par ailleurs, les régions d’intérêt peuvent être enrichies par une approche de capture. La banque de gènes rapporteurs est transfectée dans des cellules en culture. Par la suite, l’ARNm est isolé et l’ADNc est synthétisé. Les régions clonées sont séquencées à partir de la banque de plasmides (contrôle) et de l’ADNc. Les différences d’enrichissement par rapport au contrôle sont proportionnelles à l’activité de l’enhancer. Dans les deux cas, l’effet de l’enhancer sur le promoteur basal est indiqué par une flèche.
Dans le texte
thumbnail Figure 2

Étude d’éléments cis-régulateurs par CRISPR/Cas9. La technologie CRISPR/Cas9 permet d’éditer l’ADN génomique de manière ciblée grâce à un petit fragment d’ARN guide. L’endonucléase Cas9 reconnaît le complexe ARN guide/ADN et coupe le double brin d’ADN, déclenchant ainsi dans la cellule les systèmes de réparation de l’ADN. L’utilisation d’une Cas9 ayant perdu son activité d’endonucléase (dCas9) permet de cibler l’ADN sans le couper. Ainsi, la technologie CRISPR peut être utilisée pour étudier les séquences régulatrices dans leur contexte naturel par délétion d’une séquence régulatrice via l’utilisation de deux ARN guides et réparation de l’ADN par jonction d’extrémités non homologues (I) ou par remplacement d’une séquence par sa copie mutée ajoutée grâce au système de réparation par recombinaison homologue (II), modifications épigénétiques de l’ADN grâce à un modulateur épigénétique (activateur ou répresseur) couplé à la dCas9 (III), identification d’éléments régulateurs potentiels d’un gène d’intérêt en passant au crible les régions génomiques voisines par CRISPR/(d)Cas9 (IV).
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