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Accueil Tous les numéros Volume 216 / Numéro 3-4 (2022) Biologie Aujourd’hui, 216 3-4 (2022) 167-181 Full HTML
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Numéro
Biologie Aujourd’hui
Volume 216, Numéro 3-4, 2022
Page(s) 167 - 181
DOI https://doi.org/10.1051/jbio/2022020
Publié en ligne 6 février 2023

© Société de Biologie, 2023

Abréviations

ADA : Anti-Drug Antibodies

BALT : Bronchus-Associated Lymphoid Tissues

CMH : Complexe Majeur d’Histocompatibilité

ELISA : Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay

EMA : European Medicines Agency (Agence Européenne du Médicament)

FDA : Food and Drug Administration

ICH : International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use (Conseil International d’Harmonisation des Exigences Techniques pour l’Enregistrement des Médicaments à Usage Humain)

KLH : Keyhole Limpet Hemocyanin

LLNA : Local Lymph Node Assay

LLNP : Local Lymph Node Proliferation

LPS : Lipopolysaccharide

NALT : Nasal-Associated Lymphoid Tissues

NHP : Primate non humain

NOAE : No Observed Adverse Effect Level

OCDE : Organisation de Coopération et de Développement Économiques

OPPTS : Office of Prevention, Pesticides and Toxic Substances

PBMC : Cellules mononuclées du sang périphérique

PFC : Plaque-Forming Cell Assay

REACH : Registration, Evaluation, Autorisation and Restriction of Chemicals

SRBC : Erythrocytes de mouton (Sheep Red Blood Cells)

TDAR : T-cell Dependent Antibody Response

TIAR : T-cell Independent Antibody Response

TT : Tetanus toxoid (anatoxine tétanique)

US EPA : US Environmental Protection Agency (Agence de Protection de l’Environnement des États-Unis)

Introduction

L’immunotoxicologie est l’étude du dysfonctionnement du système immunitaire induit par l’exposition à un xénobiotique chimique ou biologique. L’immunotoxicité peut se manifester par une immunosuppression, une immunostimulation, une allergie ou une réaction auto-immune (Tableau 1) (Peyton Myers, 2018). C’est une branche relativement récente de l’évaluation toxicologique des xénobiotiques qui s’applique à divers produits qui peuvent impacter la santé humaine et animale : pharmaceutiques (médicaments, cosmétiques), agro-alimentaires (pesticides, additifs alimentaires), chimiques, environnementaux (métaux lourds, particules), professionnels (hydrocarbures aromatiques polycycliques), entre autres (Anderson & Shane, 2018). Alors que des cas d’allergie et d’hypersensibilité à un produit étaient déjà documentés, notamment pour les pathologies respiratoires (Descotes, 2012), les cas d’immunosuppression sont signalés depuis les années 1970 et c’est en 1977 qu’est publiée la première revue d’immunotoxicologie (Vos & Moore, 1977). À la suite de l’émergence des médicaments immunomodulateurs, le domaine de l’immunotoxicologie est apparu en 1983. Ces immunomodulateurs peuvent altérer le fonctionnement du système immunitaire et sont notamment utilisés dans la transplantation d’organe, la chimiothérapie et le traitement de maladies auto-immunes (Luster, 2014). Par ailleurs, de nombreux nouveaux traitements utilisent des molécules issues des biotechnologies comme les anticorps monoclonaux, les protéines recombinantes (cytokines, hormones, facteurs de croissance) ou les protéines de substitution (facteurs de coagulation, enzymes). En raison de leur taille plus importante que celle des molécules conventionnelles et du degré d’humanisation des anticorps, ces protéines peuvent présenter une immunogénicité et générer des anticorps dirigés contre ces médicaments, les ADA (Anti-Drug Antibodies). Ces ADA peuvent notamment diminuer l’efficacité du traitement ou mettre en danger le patient par une réponse auto-immune (Meunier et al., 2020).

Bien que les méthodes analytiques en immunologie soient déjà développées et utilisées communément dans les laboratoires, dans les premiers temps de l’immunotoxicologie, l’absence de standardisation des plans d’étude expérimentaux rendait délicate la comparaison des résultats entre les différents laboratoires (Germolec et al., 2017). Des lignes directrices ont été mises en place à partir de 1996 afin de répondre à cette problématique et aux exigences réglementaires (Hartung & Corsini, 2013) découlant des référentiels de l’Organisation de Coopération et de Développement Économiques (OCDE) (Dean et al., 1998 ; Boverhof et al., 2014). L’OCDE propose des lignes directrices généralistes permettant de détecter des effets immunotoxiques de produits chimiques, comme par exemple OCDE 407 pour le rat (OECD, 2008) et OCDE 409 pour les non rongeurs (OECD, 1998), qui ont été publiées en 1981. En 1995, elles ont été revues afin d’ajouter la mention de l’immunotoxicité. Les premières lignes directrices spécifiques concernaient les tests in vivo sur les rongeurs pour les pesticides, publiées par l’Agence de Protection de l’Environnement des États-Unis (US Environmental Protection Agency, US EPA) en 1996 avec les lignes directrices OPPTS 880.3550 (US EPA, 1996a) et OPPTS 870.7800 (US EPA, 1996c) pour évaluer l’immunotoxicité et OPPTS 880.3800 (US EPA, 1996b) pour évaluer la réponse immunitaire. L’OCDE a ensuite proposé en 2018 des lignes directrices plus spécifiques, avec OCDE 443 concernant les études de reprotoxicité (OECD, 2018) et OCDE 406 « Sensibilisation de la peau » (OECD, 2022). Pour les médicaments à usage humain, la ligne directrice S8 (EMA, 2018b) a été rédigée par le Conseil International d’Harmonisation des Exigences Techniques pour l’Enregistrement des Médicaments à Usage Humain (International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use, ICH). Les produits biotechnologiques ont leur procédure spécifique dans la ligne directrice S6 de l’ICH (EMA, 2018a). Ces lignes directrices sont reprises notamment par les agences de santé européenne (Agence Européenne du Médicament ou European Medicines Agency, EMA) et américaine (Food and Drug Administration, FDA), mais l’évaluation des effets allergisants ou auto-immuns n’y est pas décrite. Concernant les produits chimiques, le règlement REACH (Registration, Evaluation, Autorisation and Restriction of Chemicals) ne demande pas de réaliser des tests d’immunotoxicité en première intention. Cependant, le règlement REACH impose d’effectuer des études à doses répétées pour les essais d’immunotoxicologie à court (28 jours) ou à long terme (90 jours) (The European Commission, 2018).

Tableau 1

Principales conséquences cliniques liées à un mécanisme d’immunotoxicité (d’après Descotes, 2009).

Essais d’immunotoxicité pour les médicaments à usage humain

Pour l’évaluation de l’immunotoxicité d’un nouveau médicament à usage humain, les laboratoires suivent depuis le 1er mai 2006 la ligne directrice S8 établie par l’ICH. Celle-ci a pour but de permettre la détection d’un potentiel effet immunotoxique basée sur une évaluation à niveaux de preuves, puis l’exploration et l’affirmation de cet effet par des essais pertinents le cas échéant (EMA, 2018b). Tous les nouveaux médicaments à usage humain doivent être évalués pour leur immunotoxicité en plus des études de toxicologie générale. Il est recommandé d’estimer cette immunotoxicité avant la phase III (développement clinique) pour une nouvelle molécule.

Cette évaluation du potentiel immunotoxique d’un médicament à usage humain se fait par une approche à deux paliers (Dean et al., 1979, Dean, 2004 ; De Jong & Van Loveren, 2007 ; Plunkett et al., 2010) :

  • Le premier palier doit permettre la détection d’un effet potentiellement immunotoxique de la molécule en utilisant des tests observationnels cliniques et biologiques souvent inclus dans le développement préclinique et clinique du médicament (Tableau 2).

  • Le second palier est effectué si un effet immunotoxique est détecté, d’abord pour le confirmer puis pour l’explorer afin de décrire le mécanisme lié à l’immunotoxicité, notamment par des tests fonctionnels.

Pour le premier palier, les paramètres ou marqueurs peuvent être (i) identifiés lors d’études de toxicologie générale, sur la base des propriétés pharmacologiques, pharmacocinétiques et physicochimiques du principe actif, et (ii) associés à une population ciblée particulière (immunodéprimés) ou à des conditions d’administrations particulières ou encore d’après des données cliniques (Tableau 2). En plus de la présence ou non de ces marqueurs, il est également important de prendre en compte la significativité statistique des résultats, la sévérité des effets, les doses et durées d’exposition pour lesquelles il y a eu un effet, le nombre d’espèces atteintes, la réversibilité des effets, les facteurs de stress associés à l’étude, ainsi que les cellules atteintes et le mécanisme de l’effet toxique observé. L’évaluation de ces marqueurs d’immunotoxicité permet la mise en place ou non d’une étude proprement dite de l’immunotoxicité de la molécule. La présence d’un seul marqueur d’intensité suffisante peut justifier les études d’immunotoxicité. Si cette évaluation n’est pas réalisée, elle doit être justifiée par l’entreprise qui développe la molécule.

Le plan d’étude d’évaluation de l’immunotoxicité doit, selon la ligne directrice ICH S8, prendre en compte les doses, la durée d’exposition, la voie d’administration et l’espèce utilisée.

Le choix de l’espèce repose sur la capacité de la molécule à être pharmacologiquement active chez l’animal. Ce choix est donc basé sur le degré d’homologie de la cible (récepteur, épitope) entre l’animal et l’homme, l’affinité de liaison, les similitudes pharmacocinétiques et les données obtenues lors d’études précliniques de toxicologie générale. Les espèces utilisées dans les études d’immunotoxicologie sont les rongeurs (souris, rat), le lapin, le miniporc, le chien et les primates non humains (singes cynomolgus et rhésus) (Kuper et al., 2016). La souris est souvent utilisée pour réaliser des études d’immunologie fondamentale car son génotype et sa réponse immunitaire générale sont connus (Koller, 2001 ; Corsini & Loveren, 2014). Les primates non humains sont de plus de plus inclus dans les études avec l’avènement des biotechnologies (protéines recombinantes ou de substitution, anticorps monoclonaux). Par exemple, le choix du singe cynomolgus (Macaca fasciularis) dont la génétique et la physiologie sont proches de celles de l’Homme, notamment en immunologie, en endocrinologie et en neurologie, permet de mieux prédire les risques toxicologiques chez l’Homme. Il est par ailleurs recommandé d’évaluer l’immunotoxicité chez les deux sexes (Boisseau & Perrot, 2012 ; Kawabata & Evans, 2012).

La dose sélectionnée doit être suffisamment élevée et supérieure à la NOAEL (No Observed Adverse Effect Level), tout en évitant de générer une toxicité systémique liée par exemple au stress (EMA, 2018b). Il est recommandé d’évaluer plusieurs doses sur un schéma répété afin de déterminer l’existence ou non d’un effet-dose ainsi que la dose pharmacologiquement active la plus élevée sans effets immunologiques. Concernant la voie d’administration, il est recommandé d’utiliser la même que celle qui sera utilisée chez l’Homme.

La durée d’exposition à la molécule à tester doit être suffisamment longue pour suivre la cinétique des marqueurs de modifications du système immunitaire. Pour une étude s’intéressant à la réponse humorale en utilisant le test TDAR (voir plus loin), ces marqueurs sont les immunoglobulines M (IgM) et G (IgG). Afin de couvrir la demi-vie de ces immunoglobulines, il est nécessaire de réaliser une étude ayant une durée de 21 à 30 jours (28 jours en moyenne). Certaines études peuvent être de plus longue durée (90 jours) : c’est le cas pour l’évaluation des vaccins qui prennent aussi en compte le phénomène de mémoire immunitaire avec les stratégies de rappels vaccinaux.

Tableau 2

Principaux marqueurs d’immunotoxicité en toxicologie générale selon le facteur de risque étudié (d’après EMA, 2018b).

Techniques d’évaluation du mécanisme de l’immunotoxicité

L’évaluation de l’immunotoxicité peut être réalisée in vivo (directement dans l’organisme vivant), in vitro (sur des cultures primaires ou des lignées cellulaires, la molécule testée étant ajoutée lors de la culture) ou ex vivo (les animaux sont traités puis les tissus ou les cellules sont prélevés pour être directement analysés ou cultivés in vitro). Les tests sont observationnels ou fonctionnels.

La préoccupation du bien-être animal a eu comme conséquence la mise en place de la règle des 3R (réduire, remplacer, raffiner). De ce fait, les tests in vitro constituent une approche éthiquement mieux acceptée grâce à l’utilisation de cellules, de lignées cellulaires ou de composants cellulaires, de préférence issus de l’Homme. Cependant, il est nécessaire de bien caractériser les populations cellulaires car cette technique n’est pas toujours représentative des mécanismes en jeu dans un organisme entier (Karmaus & Karmaus, 2018). Par ailleurs, il n’est pas encore possible de reproduire correctement l’ensemble du processus de l’immunisation in vitro avec la totalité des partenaires cellulaires. C’est pourquoi les modèles animaux sont encore utiles et utilisés pour étudier ce processus de manière plus pertinente.

Selon la ligne directrice ICH S8, chaque test utilisé doit être validé par le laboratoire qui l’emploie pour répondre à des exigences qualité. Les critères de validation à démontrer sont au minimum la précision intra- et inter-essais, la détermination des limites de quantification et la stabilité des échantillons. Il est aussi recommandé de bien caractériser le contrôle positif, élément essentiel lors des analyses permettant de valider les résultats, et de travailler dans un environnement respectant les Bonnes Pratiques de Laboratoire.

Les tests observationnels en immunotoxicologie

Les tests observationnels permettent d’identifier les variations biologiques ou cliniques suggérant des effets immunotoxiques. Ils utilisent notamment des techniques de toxicologie générale comme l’anatomopathologie, le dosage des cytokines dans le sérum ou le plasma, le dosage des immunoglobulines sériques et l’immunophénotypage.

L’anatomopathologie apprécie dans un premier temps sur le plan macroscopique la modification de la forme, la taille ou l’aspect des organes ou des tissus lymphoïdes comme le thymus, la rate et les ganglions lymphatiques drainant la zone d’administration du médicament (Boisseau & Perrot, 2012). Lors des mesures, l’âge, le sexe, l’origine de l’élevage, l’état nutritionnel, les variations hormonales, le stress ou encore la présence d’infections ou de tumeurs sont notés. En effet, des variabilités inter-individuelles et intra-individuelles peuvent exister pour cette approche et doivent être prises en compte dans l’évaluation des risques.

L’anatomopathologie permet ensuite d’apprécier sur le plan microscopique et de manière semi-quantitative les modifications liées aux cellules des mêmes organes lymphoïdes (Boisseau & Perrot, 2012 ; Elmore, 2012). Des prélèvements complémentaires peuvent être réalisés en fonction de la voie d’administration du produit, comme par exemple les plaques de Peyer au niveau intestinal pour la voie orale, les tissus lymphoïdes associés aux bronches (Bronchus-Associated Lymphoid Tissues ou BALT) et les tissus lymphoïdes associés à la cavité nasale (Nasal-Associated Lymphoid Tissues ou NALT) pour la voie respiratoire.

Les immunoglobulines sériques sont dosées de façon non spécifique (Ig totales) ou par isotype (IgG, IgM, IgA, IgE). Cette analyse permet de montrer l’aspect général de la réponse immunitaire humorale en cas d’anomalies des globulines et en absence d’étiologies hépatiques ou rénales. Le dosage des immunoglobulines sériques se fait principalement par technique ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) et plus rarement par immunofixation. Les limites de ce dosage s’expliquent par le fait que les résultats ne sont qu’un reflet de la réponse immunitaire humorale générale. Cette technique n’est pas informative dans le suivi d’un traitement en cours car elle ne prend en compte ni la stimulation antigénique, ni la spécificité antigénique c’est-à-dire la capacité d’un antigène à être reconnu par l’immunoglobuline.

Les cytokines peuvent aussi être quantifiées afin de préciser le mécanisme d’immunotoxicité de la molécule étudiée. Cependant, plusieurs contraintes liées à leurs caractéristiques en limitent l’intérêt : elles ont une demi-vie brève, peuvent agir à longue distance et sont en faible concentration même après stimulation (de l’ordre du pg/mL) (Ai et al., 2013). En effet, contrairement aux hormones qui sont secrétées constitutivement et dont l’action est modulée en fonction de la quantité présente, les cytokines ne sont sécrétées qu’en réponse à un stimulus. Les analyses de cytokines peuvent être réalisées à partir de prélèvements de sang total ou de sérum ou à partir de cultures ex vivo ou in vitro, et peuvent concerner les molécules elles-mêmes par différentes techniques ELISA (singleplex, multiplex, ELISPOT), ou leurs ARN messagers par RT-PCR quantitative.

Enfin, l’immunophénotypage permet l’identification et l’énumération des leucocytes par l’utilisation d’anticorps spécifiques de marqueurs de surface plus ou moins spécifiques d’un type cellulaire, et la cytométrie en flux ou l’immunohistochimie. Il permet d’observer la variation quantitative de cellules d’une population (pourcentage de cellules positives) ou le taux d’expression d’un marqueur (intensité du signal par cellule). Pour les études de toxicité à doses répétées, l’immunophénotypage permet de suivre les variations des populations cellulaires pendant les périodes avec et sans exposition à la molécule (EMA, 2018b ; Espenschied et al., 2018).

Les tests fonctionnels en immunotoxicologie

Les tests fonctionnels renseignent sur la fonction immunitaire et aident à caractériser les mécanismes d’immunotoxicité. Ils peuvent être réalisés in vitro ou in vivo.

Tests in vitro et ex vivo

Les tests fonctionnels in vitro utilisant des cultures cellulaires ont été développés après l’émergence de la notion du bien-être animal et l’application de la règle des 3R. Ils englobent le test de prolifération lymphocytaire (lymphocytes B et T), la mesure de l’activité des cellules NK, le test de relargage des cytokines et la mesure de l’activité des macrophages et des polynucléaires.

Le test de prolifération lymphocytaire repose sur la capacité des lymphocytes (T ou B) à répondre à une stimulation antigénique, ce qui constitue un paramètre de l’immunité cellulaire. Cette réponse est mesurée par leur capacité de prolifération en culture in vitro (Oellerich et al., 2012 ; Descotes, 2014). La stimulation antigénique est médiée par l’utilisation de mitogènes comme le lipopolysaccharide d’Escherichia coli pour les lymphocytes B et les anticorps anti-CD3 et anti-CD28 pour les lymphocytes T. La prolifération est estimée par la mesure de l’incorporation de la thymidine tritiée dans l’ADN, ou par la quantification de la bromodésoxyuridine ou de l’antigène PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen) par cytométrie en flux.

L’activité des cellules NK est mesurée si l’immunophénotypage montre une anomalie numérique de ces cellules ou si une augmentation du taux d’incidence d’infections virales ou de tumeurs est observée chez les animaux lors des études précliniques. Il s’agît d’un test de relargage du chrome 51 (51Cr) par les cellules cibles, en l’occurrence des cellules tumorales ne présentant pas à leur surface des molécules du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) de classe I préalablement marquées par le 51Cr et qui sont lysées par les cellules NK secrétant les perforines et les granzymes lors d’une coculture. La quantification de la radioactivité libérée par les cellules informe sur l’efficacité de la lyse des cellules cibles par les cellules NK. Des méthodes non radioactives utilisant la calcéine acétoxyméthylée (Lorenzo-Herrero et al., 2020) ou l’ester succinimidylique de carboxyfluorescéine (Nagarkatti et al., 2018) sont de plus en plus utilisées. L’activité cytolytique des lymphocytes TCD8+ est aussi mesurée par le test du relargage du 51Cr mais nécessite une activation préalable par les lymphocytes TCD4+ helper afin d’exprimer à leur surface des récepteurs spécifiques de l’antigène.

Les macrophages et les polynucléaires jouent un rôle dans l’inflammation via leur capacité de migration par chimiotactisme, de phagocytose, de présentation d’antigènes ou encore de synthèse de cytokines pro-inflammatoires (Germolec et al., 2018). Le chimiotactisme est évalué par le test de migration cellulaire dans une chambre de Boyden avec les cellules d’un côté de la membrane et les molécules chimio-attractantes de l’autre (Chen, 2005). La capacité migratoire est quantifiée par microscopie et comptage cellulaire, par cytométrie en flux ou par la mesure de l’impédance électrique des cellules (Taylor et al., 2018). Le test de phagocytose utilise des agents immunogènes (billes de latex, particules de zymosan, bactéries, champignons) couplés avec un fluorochrome (Rumianek & Greaves, 2020). Ces agents sont incubés pendant quelques heures avec les macrophages ou les polynucléaires et phagocytés par ces derniers. Après incubation, la capacité à phagocyter des cellules est déterminée par microscopie confocale (macrophages contenant des particules fluorescentes) ou par cytométrie en flux (mesure de l’intensité de fluorescence) (Farmer & Dietert, 2013).

Enfin, le test de relargage des cytokines, bien qu’il ne soit pas présent dans l’ICH S8, est utile dans le développement des produits issus des biotechnologies. Il permet de mettre en évidence le syndrome de relargage des cytokines ou tempête cytokinique (réponse anormale par une production excessive de cytokines). Ce phénomène est observé par exemple en réponse à l’administration de certains anticorps monoclonaux thérapeutiques ou de cellules CAR-T (Grimaldi et al., 2016), ou encore à la suite de toute stimulation non contrôlée du système immunitaire. Le principe consiste à mettre en culture les cellules du sang total ou les cellules mononuclées du sang périphérique en présence de la molécule à tester, et de doser les cytokines sécrétées dans le surnageant de culture par une technique ELISA.

Tests in vivo

Les tests fonctionnels in vivo permettent de suivre les mécanismes en aval d’un processus d’immunisation qui ne peut pas se faire in vitro. Ces tests fonctionnels in vivo comprennent l’évaluation de la réponse humorale, de l’hypersensibilité retardée et de la résistance de l’hôte.

L’évaluation de la réponse humorale est essentielle en immunotoxicologie car elle permet d’explorer l’ensemble des fonctions immunitaires liées à la réponse adaptative humorale (Lebrec et al., 2011). Elle consiste à immuniser l’animal par un antigène thymo-dépendant ou thymo-indépendant.

L’évaluation de la réponse thymo-dépendante (T-cell Dependent Antibody Response ou TDAR) s’effectue en deux temps, avec d’abord l’immunisation des animaux par un antigène thymo-dépendant, puis la mesure des anticorps spécifiques dirigés contre cet antigène. Ce test est recommandé en première intention car il permet d’explorer les différentes composantes de l’immunité humorale comme les cellules présentatrices d’antigène, les lymphocytes T et B mais aussi la synthèse des IgM et des IgG spécifiques contre l’antigène. Ce test sera plus largement développé dans la partie suivante.

L’évaluation de la réponse thymo-indépendante (T-cell Independent Antibody Response ou TIAR) n’est utilisée que dans des cas très précis. En effet elle permet de déterminer l’état fonctionnel des lymphocytes B et de préciser les mécanismes toxiques de la molécule testée sur cette population cellulaire (Janeway et al., 2001). Comme pour le test TDAR, l’évaluation de la réponse thymo-indépendante repose sur le principe d’immunisation puis de mesure des anticorps spécifiques (Grant et al., 2012). Les antigènes thymo-indépendants utilisés sont le 2,4 dinitrophényl-Ficoll (DNP-Ficoll), le lipopolysaccharide conjugué à l’haptène 2,4,6-trinitrophényl (TNP-LPS), l’acide polyinosinique-polycytidylique (CpG) et la flagelline (Sharon et al., 1975 ; Dintzis et al., 1982 ; Mond et al., 1995).

L’hypersensibilité retardée à un antigène permet d’évaluer l’immunité cellulaire chez les souris, les rats et les singes (Bouchez et al., 2012 ; EMA, 2018b) en utilisant le test de stimulation locale du ganglion lymphatique (Local Lymph Node Assay ou LLNA) ou de prolifération locale du ganglion lymphatique (Local Lymph Node Proliferation ou LLNP) (Potter et al., 2018). Le principe de ces tests repose sur l’immunisation quotidienne des animaux avec un antigène (KLH ou keyhole limpet hemocyanin, ovalbumine, anatoxine tétanique ou des nanoparticules) pendant trois jours. L’antigène est appliqué sur la peau de l’oreille de l’animal dans le test LLNA et injecté dans le test LLNP. Après une phase de repos de 3 jours, la thymidine tritiée est injectée chez l’animal qui est sacrifié 6 heures plus tard et les ganglions lymphatiques sont prélevés pour analyse. Les paramètres qui sont analysés sur l’animal entier ou sur des prélèvements sont la taille de l’inflammation au niveau des oreilles (rougeur, œdème ; paramètre macroscopique), l’infiltration des macrophages et des lymphocytes T au niveau des oreilles et des ganglions drainants (paramètre microscopique) et la mesure de la lymphoprolifération par la thymidine tritiée.

Enfin, l’étude de résistance de l’hôte face à l’inoculation d’un agent infectieux (bactérie, champignon, virus ou parasite), ou de cellules cancéreuses en présence de la molécule à tester, est une autre approche pour évaluer la fonction immunitaire dans sa globalité (Burleson & Burleson, 2008 ; Burleson et al., 2018 ; EMA, 2018b). L’étude de résistance de l’hôte s’intéresse à la capacité d’un organisme à éliminer un agent infectieux (clairance). Ce test dure en général 28 jours et utilise deux espèces de rongeurs (rats, souris), dont l’une est le contrôle négatif. Le virus de la grippe est le modèle infectieux le plus utilisé mais d’autres agents pathogènes peuvent l’être également pour cibler une population cellulaire ou un organe spécifique. Ainsi, Streptococcus pneumoniae est employé pour l’étude des neutrophiles, des macrophages, des anti-inflammatoires ou de molécules ciblant TNFα, Listeria monocytogenes pour les cellules de Küpfler et les macrophages alvéolaires, Candida albicans comme modèle fongique, le cytomégalovirus murin pour la latence et la réactivation virale, et Plasmodium yoelii et Trichinella spiralis pour les modèles parasitaires. Après inoculation, la charge biologique, c’est-à-dire la quantité de micro-organismes présents dans un tissu comme le sang, la rate, le poumon ou le foie, est mesurée à différents temps. La clairance de l’agent infectieux s’appuie ainsi sur l’évolution de la charge biologique mesurée au sein de la matrice ou d’un organe. Pour les modèles tumoraux, les lignées cellulaires utilisées sont B16F10 (mélanome) et PYB6 (sarcome).

Le test TDAR en immunotoxicologie

La réponse thymo-dépendante concerne les antigènes protéiques et implique plusieurs acteurs de l’immunité, nécessitant donc une évaluation in vivo. Le test TDAR permet une évaluation fonctionnelle in vivo du système immunitaire de l’animal lorsque celui-ci reçoit un traitement expérimental. Pour évaluer cette réponse, un antigène fortement immunogène est injecté aux animaux selon un schéma vaccinal préalablement défini (une seule ou plusieurs immunisations), et la réponse immunitaire est appréciée par la quantification (par ELISA) des anticorps IgM et IgG qui sont produits spécifiquement contre l’antigène utilisé (Peachee et al., 2014). Ce test permet de suivre la réponse humorale spécifique dans des conditions reproductibles de stimulation antigénique. C’est pourquoi le test TDAR est obligatoire selon la ligne directrice 443 de l’OCDE (OECD, 2018) pour l’évaluation de produits chimiques qui ne sont pas soumis à d’autres règlementations comme c’est le cas pour les médicaments à usage humain et vétérinaire, les cosmétiques, les dispositifs médicaux, les substances radioactives, les produits agroalimentaires, les tissus d’origine humaine ou animale. Il est ensuite recommandé en première intention par la ligne directrice ICH S8 pour l’évaluation de l’immunotoxicité lorsque le produit testé cible les cellules de l’immunité, ou si une immunotoxicité est fortement suspectée par ailleurs (Tableau 2). Il permet notamment de déceler des phénomènes d’immunodépression en cas de diminution de la réponse mais peut aussi être adapté pour révéler les immunostimulations (schéma vaccinal et doses différentes). Comme pour les autres techniques utilisées en immunotoxicité, différents paramètres doivent être déterminés pour effectuer un test TDAR.

Choix de l’espèce

Le choix de l’espèce suit la ligne directrice ICH S8. Contrairement à l’homme, le chien et le singe, les rongeurs ne possèdent pas de système immunitaire fonctionnel à la naissance (Martin, 2010), il est donc recommandé d’utiliser des rongeurs âgés d’au moins 42 jours pour de tels tests. L’effectif par groupe et par sexe trouvé dans la littérature reprend les recommandations de la ligne directrice OPPTS 870.7800 (US EPA, 1996c), avec 8–10 pour les rongeurs, 5 pour les non rongeurs et 3 pour les primates non humains. Les groupes d’animaux utilisés dans un test TDAR sont en général au nombre de 5, incluant un groupe témoin négatif recevant le solvant de l’antigène, un groupe témoin positif recevant une molécule connue pour avoir un effet immunosuppresseur puissant comme le cyclophosphamide, la dexaméthasone ou la cyclosporine (Thériaque, 2021a, 2021b, 2021c) et trois groupes recevant la molécule à tester à différentes doses (faible, moyenne et élevée) (Plitnick & Herzyk, 2010).

Choix de l’antigène

Le choix d’un antigène thymo-dépendant est une étape critique dans l’élaboration du test TDAR. En effet, cet antigène va conditionner l’immunisation de l’animal mais aussi le dosage analytique (fixé au fond des puits de la plaque d’ELISA, il va être reconnu par les anticorps IgM et IgG présents dans l’échantillon à doser). Un antigène thymo-dépendant idéal à administrer doit être immunogène (sans besoin d’adjuvants), faible en endotoxines et utilisable chez différentes espèces animales (Lebrec et al., 2014). Le tableau 3 reprend les principales caractéristiques d’antigènes utilisés pour le test TDAR.

Keyhole limpet hemocyanin (KLH) est une protéine de grande taille (4–8 MDa, 600–800 kDa par sous-unité), issue d’un mollusque marin (Megathura crenulata), qui transporte l’oxygène. KLH est l’antigène le plus couramment employé car il donne des résultats d’immunisation robustes chez les mammifères, peut être utilisé comme transporteur pour les haptènes ou en tant qu’adjuvant, est facilement accessible dans le commerce et permet l’évaluation de la réponse primaire (IgM) comme secondaire (IgG) par technique ELISA (Plitnick & Herzyk, 2010). Son inconvénient réside dans la présence potentielle d’une réactivité croisée au niveau des anticorps anti-KLH chez les primates non humains (NHP). En effet, l’épitope de KLH possède une structure proche de celui d’un antigène présent chez le parasite Schistosoma mansoni (Geyer et al., 2005), qui a un taux d’infection élevé chez les NHP (environ 10 % chez les souches africaines) (Richards et al., 2019). Cette réactivité croisée peut donc rendre l’interprétation des résultats délicate car le modèle animal ayant rencontré le parasite présente une concentration d’anticorps plus élevée qu’un animal naïf. Dans ce cas, il n’est pas possible d’évaluer la fonction immunitaire à la suite d’une primo-immunisation à la KLH.

Les érythrocytes de mouton (Sheep Red Blood Cells ou SRBC), qui présentent une très bonne immunogénicité (Ladics, 2018), ont été historiquement le premier type d’antigène utilisé dans le test TDAR. Ils constituent l’antigène d’immunisation pour les tests TDAR dirigés contre les produits environnementaux (pesticides) et autres produits chimiques selon la ligne directrice 870.7800 de l’OPPTS (US EPA, 1996c). Ils sont moins employés dans le domaine pharmaceutique car ils ont une faible stabilité et une durée de conservation relativement brève. Le choix de la source d’approvisionnement constitue donc une étape critique dans l’élaboration d’un test TDAR utilisant cet antigène. De plus, les SRBC sont déconseillés pour immuniser les chiens car des réactions d’hypersensibilité ont été décrites (Haggerty, 2007). Enfin, la récupération des SRBC nécessite de sacrifier les animaux pour prélever la rate, contrairement aux autres antigènes.

Le vaccin contre le tétanos (tetanus toxoid ou TT) est une anatoxine de la bactérie Clostridium tetani, l’agent infectieux du tétanos (Rabadi & Brady, 2022). Pour le test TDAR, cet antigène peut être utilisé comme alternative à la KLH car il induit une réponse clinique plus visible (érythème, épaississement cutané, œdème) (Bouchez et al., 2012). La majorité des hommes et des primates utilisés comme animaux de laboratoire étant déjà vaccinée contre cette bactérie, il est important de confirmer le statut vaccinal d’un primate non humain avant immunisation. Un inconvénient est que la plupart des vaccins commercialisés contiennent un adjuvant (par exemple l’hydroxyde d’aluminium) qui peut entraîner une exacerbation de la réponse immunitaire. De ce fait, le TT est plutôt utilisé pour étudier la fonction de mémoire immunitaire (rappel vaccinal).

La protéine HBsAg est un antigène de surface situé au niveau de l’enveloppe du virus de l’hépatite B. Sa présence dans le sérum du patient est un marqueur d’infection par ce virus. Par ses caractéristiques immunogènes, la protéine HBsAg fait partie de la composition du vaccin contre l’hépatite B (Kaul, 2013). Cette protéine HBsAg est une alternative à l’utilisation de la KLH d’une part pour la facilité de son approvisionnement (vaccin) et d’autre part pour une utilisation plus sûre satisfaisant aux exigences règlementaires de qualité et de sécurité avant la mise sur le marché (ScienceDirect, 2017). De nos jours, cet antigène est devenu quasiment historique en raison d’une meilleure disponibilité de la KLH. La protéine HBsAg est moins rencontrée chez les NHP que le TT, elle est donc utilisable pour mimer une primo-infection avant l’étude des mécanismes de rappel. Par ailleurs, la réponse immunitaire est plus importante et moins variable qu’avec le TT.

Le bactériophage phiX174 (ΦX174) est un virus à ADN simple brin circulaire de la famille des Microviridae (Logel & Jaschke, 2020). Un des avantages de cet antigène est la possibilité de l’utiliser comme agent d’immunisation chez plusieurs espèces animales (mammifères et autres vertébrés). L’inconvénient majeur de ΦX174 est sa difficulté d’approvisionnement, cet antigène n’étant pas commercialisé (Orange et al., 2012). En conséquence, cela limite l’utilisation de ΦX174 aux études non cliniques.

Tableau 3

Comparaison des différents antigènes utilisés pour le test TDAR (Lebrec et al., 2014). Les comparaisons sont basées sur le type d’utilisation possible, les espèces animales immunisables ainsi que sur les avantages et les inconvénients liés à l’efficacité d’immunisation et la gestion des réactifs. HBsAg : antigène de surface du virus de l’hépatite B ; KLH : keyhole limpet hemocyanin ; ΦX174 : bactériophage phiX174 ; NHP, primates non humains ; SRBC : érythrocytes de mouton ; TT : tetanus toxoid.

Choix de la dose et de la voie d’administration

L’administration de l’antigène se fait par voie parentérale, avec des doses qui dépendent de l’antigène, de la voie et de l’espèce utilisés (Tableau 4).

Tableau 4

Choix de la dose et de la voie d’administration selon l’espèce et l’antigène (Lebrec et al., 2014 : Peachee et al., 2014). HBsAg : antigène de surface du virus de l’hépatite B ; IV : intraveineux ; IM : intramusculaire ; KLH : keyhole limpet hemocyanin ; LF : limite de floculation ; PFU : plate forming unit (nombre de virus par plaque) ; ΦX174 : bactériophage phiX174 ; SC : sous-cutané ; SRBC : érythrocytes de mouton ; TT : tetanus toxoid.

Choix de la durée de traitement

Bien que la ligne directrice ICH S8 recommande de réaliser une étude de 28 jours en moyenne, plusieurs critères tels que la demi-vie des anticorps IgM et IgG, les mécanismes résolutifs suivant l’immunisation mais aussi la nouvelle réponse à la suite de la deuxième immunisation, peuvent conditionner la durée, notamment lorsque la mémoire immunitaire est évaluée. Comme illustré dans la figure 1, la deuxième exposition induit une réponse immunitaire plus efficace que la première, montrant l’importance de réaliser une étude longue afin de pouvoir observer cet effet. Le moment de l’immunisation est également un critère à prendre en compte dans l’élaboration du protocole d’étude. L’immunisation peut être réalisée une ou deux fois selon les besoins de l’étude. Par exemple, pour générer des contrôles positifs, une seule immunisation suffit car la réponse est déjà importante, tandis que pour évaluer la mémoire immunitaire, deux immunisations sont nécessaires (American College of Toxicology, 2020). L’administration de la molécule à évaluer et du cyclophosphamide se fait au premier jour de l’étude. La figure 2 présente des exemples de protocole d’étude pour le test TDAR sur une durée de 28 jours. Dans ce cas, la première immunisation est réalisée à J7 chez les singes et à J14 chez les rongeurs (Burns-Naas & Pallardy, 2013 ; Kawai et al., 2013). Pour une étude de plus longue durée (3 mois), deux immunisations sont réalisées afin d’évaluer les réponses primaire et secondaire, la deuxième immunisation étant effectuée 4 à 6 semaines après la première afin de laisser le taux d’anticorps diminuer (Figure 1) (Bannish, 2018). Les prélèvements sanguins se font en général tous les 7 jours à partir du premier jour d’immunisation.

thumbnail Figure 1

Évolution du taux d’anticorps selon le nombre d’immunisations. Les pics de concentration d’anticorps ciblant l’antigène se situent en général au 14e jour pour la réponse immunitaire primaire puis au 42e jour pour la réponse immunitaire secondaire suivant la première exposition. Ag : antigène ; LB : lymphocyte. (Figure inspirée de Mahalingam et al., 2021).
thumbnail Figure 2

Exemples de plans d’étude pour le test TDAR. Le CPA a été administré quotidiennement par voie orale. (A) Les rats sont immunisés par injection intraveineuse de la KLH au jour 23 ou 24 de l’étude. Le sang est prélevé à la fin de l’étude (ici au jour 29) afin de récupérer le sérum et de titrer les IgM anti-KLH par ELISA. (B) Les rats sont immunisés en milieu d’étude (ici au jour 15). Des prélèvements sanguins sont réalisés au jour 20 et au jour 29 afin d’évaluer respectivement les réponses primaire (IgM) et secondaire (IgG). (C) Les singes sont immunisés deux fois, 7 jours avant et après le début de l’étude, par un premier antigène (KLH) afin d’évaluer l’impact de la molécule sur la réponse secondaire anti-KLH. Le TT est administré deux semaines après le début de l’étude afin d’évaluer l’impact de la molécule sur la réponse primaire anti-TT. Ce plan d’étude permet d’évaluer la fonction immunitaire sur deux antigènes différents. CPS : cyclophosphamide (immunosuppresseur) ; ELISA : enzyme-linked immunosorbent assay ; IgG : immunoglobulines G ; IgM : immunoglobulines M ; KLH : keyhole limpet hemocyanin ; TT : tetanus toxoid (Figure inspirée de Burns-Naas & Pallardy, 2013, et Kawai et al., 2013).

Choix de la méthode analytique

La méthode analytique doit permettre la quantification du taux d’anticorps dirigés contre l’antigène d’immunisation. La majorité des tests TDAR utilise une technique ELISA (directe, indirecte, par compétition ou en sandwich) mais on peut trouver dans la littérature l’électro-chimio-luminescence ou encore la technique Plaque-Forming Cell Assay (PFC) (Tableau 5). Les tests ELISA sont ceux classiquement utilisés en immunologie. L’électro-chimio-luminescence implique la détection de la lumière produite par une réaction électrochimique, grâce au couplage de l’anticorps de détection avec un luminophore à base de ruthénium (Ru(bpy)32+). Enfin, le PFC consiste à quantifier le nombre de plasmocytes dans la rate après immunisation (souris ou rat) par les SRBC (Ladics, 2018). Quatre à cinq jours après immunisation par ces cellules, l’animal est sacrifié, les splénocytes sont isolés et mis en suspension dans du sérum de cochon d’Inde (contenant les facteurs du complément) avec les SRBC et une solution d’agar-agar. Cette suspension est incubée dans une boîte de Pétri pendant 3 heures à 37 °C. Les plasmocytes vont produire des anticorps IgM anti-SRBC qui diffusent dans la boîte de Pétri, reconnaissent l’antigène SRBC et s’y fixent. Ils vont ensuite changer de conformation et activer la cascade du complément. Le système du complément va induire la lyse des SRBC et la décoloration de la zone (appelée « plaque »). L’observation se fait au microscope et les plaques sont comptées. Cela permet de déterminer le « PFC », à savoir le nombre de cellules qui produisent des anticorps et donc de plaques par rate ou par million de splénocytes. Les avantages et inconvénients de ces trois méthodes analytiques sont repris dans le tableau 5. La validation des méthodes intègre la précision évaluée par le coefficient de variation (CV) qui doit être inférieur à 30 %. Les techniques ELISA et ECL permettent plus facilement de respecter ce critère.

Tableau 5

Comparaison des méthodes analytiques utilisées pour le test TDAR (Lebrec et al., 2014). ECL : électrochimioluminescence ; ELISA : enzyme-linked immunosorbent assay ; HBsAg : antigène de surface du virus de l’hépatite B ; IgG : immunoglobulines G ; IgM : immunoglobulines M ; KLH : keyhole limpet hemocyanin ; NHP : primates non humains ; PFC : plaque forming cell ; SRBC : érythrocytes de mouton ; TT : tetanus toxoid.

Conclusion et perspectives

L’immunotoxicologie étudie le dysfonctionnement immunitaire à la suite d’une exposition à un xénobiotique. Cette branche récente de la toxicologie est de nos jours de plus en plus demandée dans l’évaluation de la sécurité de divers produits de consommation avant leur commercialisation, dont les médicaments (notamment les immunomodulateurs et les produits issus des biotechnologies). L’approche par palier permet d’évaluer un potentiel risque immunotoxique par des tests observationnels cliniques et biologiques, puis de confirmer cet effet par des tests fonctionnels si nécessaire. Le test fonctionnel de première intention en immunotoxicologie est le test TDAR qui évalue chez l’animal in vivo la capacité du système immunitaire à établir une réponse humorale thymo-dépendante après une immunisation par un antigène. Cette capacité est modifiée par les molécules immunotoxiques. L’analyse du test TDAR repose couramment sur la titration des anticorps IgG et IgM anti-KLH par technique ELISA. Bien que considéré comme le gold standard des tests fonctionnels en immunotoxicologie, le test TDAR ne dispose pas de protocole standardisé permettant aux laboratoires d’adapter leur procédure.

L’enjeu majeur pour l’évaluation de l’immunotoxicité dans les différents domaines (santé, agroalimentaire, chimie…) devrait être le remplacement d’animaux de laboratoire par des essais fiables et reproductibles utilisant du matériel biologique standardisé et facile d’accès comme des lignées cellulaires. De nouveaux tests permettent l’étude de tel ou tel paramètre ou lignée cellulaire de façon isolée (Yao et al., 2020), ce qui diminue l’utilisation des animaux tout en augmentant le nombre d’expériences à effectuer. Cependant, la corrélation entre les résultats des tests in vitro et la réalité in vivo n’est au mieux que partielle (Galbiati et al., 2010 ; Dobrovolskaia & McNeil, 2013 ; Hartung & Corsini, 2013). Afin de garantir une pertinence biologique des tests, ceux-ci devraient intégrer un ensemble de cellules différentes représentées dans des proportions et des niveaux d’activité et d’activation similaires à ceux trouvés dans l’organisme, voire dans différents organes. Cela semble aujourd’hui une perspective difficile à atteindre, mais les technologies actuelles permettant l’élaboration et l’étude d’organoïdes, de sphéroïdes et de tissus bio-imprimés devraient permettre le développement d’outils pouvant remplacer du moins partiellement, petit à petit, l’emploi d’animaux dans ces tests. Une autre voie de recherche réside dans l’utilisation d’autres animaux, peut-être mieux tolérés au niveau sociétal, comme les moules et les oursins (Auguste et al., 2022).

Références

Citation de l’article : Nguyen, C. et Jordheim, L.P. (2022). Évaluation de l’immunotoxicité en recherche et dans le cadre du développement biomédical. Biologie Aujourd’hui, 216, 167-181

Liste des tableaux

Tableau 1

Principales conséquences cliniques liées à un mécanisme d’immunotoxicité (d’après Descotes, 2009).

Dans le texte
Tableau 2

Principaux marqueurs d’immunotoxicité en toxicologie générale selon le facteur de risque étudié (d’après EMA, 2018b).

Dans le texte
Tableau 3

Comparaison des différents antigènes utilisés pour le test TDAR (Lebrec et al., 2014). Les comparaisons sont basées sur le type d’utilisation possible, les espèces animales immunisables ainsi que sur les avantages et les inconvénients liés à l’efficacité d’immunisation et la gestion des réactifs. HBsAg : antigène de surface du virus de l’hépatite B ; KLH : keyhole limpet hemocyanin ; ΦX174 : bactériophage phiX174 ; NHP, primates non humains ; SRBC : érythrocytes de mouton ; TT : tetanus toxoid.

Dans le texte
Tableau 4

Choix de la dose et de la voie d’administration selon l’espèce et l’antigène (Lebrec et al., 2014 : Peachee et al., 2014). HBsAg : antigène de surface du virus de l’hépatite B ; IV : intraveineux ; IM : intramusculaire ; KLH : keyhole limpet hemocyanin ; LF : limite de floculation ; PFU : plate forming unit (nombre de virus par plaque) ; ΦX174 : bactériophage phiX174 ; SC : sous-cutané ; SRBC : érythrocytes de mouton ; TT : tetanus toxoid.

Dans le texte
Tableau 5

Comparaison des méthodes analytiques utilisées pour le test TDAR (Lebrec et al., 2014). ECL : électrochimioluminescence ; ELISA : enzyme-linked immunosorbent assay ; HBsAg : antigène de surface du virus de l’hépatite B ; IgG : immunoglobulines G ; IgM : immunoglobulines M ; KLH : keyhole limpet hemocyanin ; NHP : primates non humains ; PFC : plaque forming cell ; SRBC : érythrocytes de mouton ; TT : tetanus toxoid.

Dans le texte

Liste des figures

thumbnail Figure 1

Évolution du taux d’anticorps selon le nombre d’immunisations. Les pics de concentration d’anticorps ciblant l’antigène se situent en général au 14e jour pour la réponse immunitaire primaire puis au 42e jour pour la réponse immunitaire secondaire suivant la première exposition. Ag : antigène ; LB : lymphocyte. (Figure inspirée de Mahalingam et al., 2021).
Dans le texte
thumbnail Figure 2

Exemples de plans d’étude pour le test TDAR. Le CPA a été administré quotidiennement par voie orale. (A) Les rats sont immunisés par injection intraveineuse de la KLH au jour 23 ou 24 de l’étude. Le sang est prélevé à la fin de l’étude (ici au jour 29) afin de récupérer le sérum et de titrer les IgM anti-KLH par ELISA. (B) Les rats sont immunisés en milieu d’étude (ici au jour 15). Des prélèvements sanguins sont réalisés au jour 20 et au jour 29 afin d’évaluer respectivement les réponses primaire (IgM) et secondaire (IgG). (C) Les singes sont immunisés deux fois, 7 jours avant et après le début de l’étude, par un premier antigène (KLH) afin d’évaluer l’impact de la molécule sur la réponse secondaire anti-KLH. Le TT est administré deux semaines après le début de l’étude afin d’évaluer l’impact de la molécule sur la réponse primaire anti-TT. Ce plan d’étude permet d’évaluer la fonction immunitaire sur deux antigènes différents. CPS : cyclophosphamide (immunosuppresseur) ; ELISA : enzyme-linked immunosorbent assay ; IgG : immunoglobulines G ; IgM : immunoglobulines M ; KLH : keyhole limpet hemocyanin ; TT : tetanus toxoid (Figure inspirée de Burns-Naas & Pallardy, 2013, et Kawai et al., 2013).
Dans le texte

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