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Accueil Tous les numéros Volume 211 / Numéro 4 (2017) Biologie Aujourd'hui, 211 4 (2017) 247-254 Full HTML
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Biologie Aujourd'hui
Volume 211, Numéro 4, 2017
Page(s) 247 - 254
Section CRISPR : d’un système immunitaire procaryote à une révolution technologique (Journée Claude Bernard)
DOI https://doi.org/10.1051/jbio/2018001
Publié en ligne 29 juin 2018

© Société de Biologie, 2018

La séquence CRISPR, une structure inhabituelle et d’origine inconnue

En 1987, Ishino et coll. observent, après la séquence du gène iap dans le génome d’Escherichia coli, une structure constituée de la répétition de cinq séquences conservées de 29 nucléotides, séparées par des espaceurs ou spacers uniques de 32 nucléotides (Ishino et al., 1987). Une seconde étude par cette même équipe montre que cette séquence n’est pas codante et qu’elle est retrouvée dans d’autres espèces proches. Aucune fonction ne lui est attribuée (Nakata et al., 1989). Des structures similaires sont observées au cours des dix années suivantes par différentes équipes, chez des bactéries et des archées. Différents noms leur sont attribués, reflétant leurs caractéristiques : Direct Variable Repeat ou DVR (Groenen et al., 1993), Tandem Repeat ou TREP (Mojica et al., 1995), Short Regularly Spaced Repeats ou SRSR (Mojica et al., 2000), Long Cluster of Tandem Repeat ou LCTR (Nelson et al., 1999), Spacers Interspaced Direct Repeats ou SPIDR (Jansen et al., 2002a). L’acronyme CRISPR pour Cluster of Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats est proposé par Jansen et coll. en 2002 (Jansen et al., 2002b). Plus que les répétitions qui sont des éléments couramment observés, ce sont les séquences uniques qui intriguent. On ne trouve aucune homologie avec les séquences présentes dans les bases de données et elles ne présentent pas de caractéristiques communes. Les répétitions, appelées DR « direct repeat », semblent par contre posséder un palindrome qui pourrait leur conférer un rôle biologique (Figure 1). La présence d’un palindrome et la localisation des CRISPR dans certains génomes d’archées conduisent à proposer un rôle dans la réplication (Mojica et al., 2000) ou dans le transfert d’ADN (Nelson et al., 1999), mais ces hypothèses apparaîtront inexactes.

L’étude publiée en 2002 par Tang et coll. démontre que la structure répétée est transcrite abondamment chez Archaeglobus fulgidus. Au cours de l’exploration de petits ARN, souvent impliqués dans la régulation de l’expression de gènes, les auteurs observent des ARN d’une taille correspondant à un DR plus un spacer, ainsi que des multiples de ces ARN et hybridant à différentes positions sur trois locus CRISPR (Tang et al., 2002). Ils en concluent qu’un long transcrit précurseur est maturé par coupures progressives en petits ARN et proposent l’hypothèse selon laquelle ces molécules pourraient jouer un rôle dans le fonctionnement du CRISPR. Cette observation sera faite chez d’autres espèces (Lillestol et al., 2006), confirmant l’importance de l’étape de transcription.

thumbnail Figure 1

Diversité des séquences DR. Séquences du DR de six CRISPR appartenant à différentes espèces bactériennes. Le palindrome est surligné et la séquence 3’ terminale AAC/G est entourée.

Les gènes cas

En 2002, Jansen et coll. montrent l’existence d’un groupe de gènes particuliers toujours situés près d’un CRISPR, et les appellent gènes cas pour CRISPR-associated (Jansen et al., 2002a). Ensemble ils forment les systèmes CRISPR-Cas. Parmi les gènes cas analysés dans cette étude, quatre sont conservés chez différentes espèces d’archées et de bactéries, et deux présentent des similarités avec des membres des Cluster of Orthologous Groups (COG). L’étude montre que dans un génome possédant plusieurs CRISPR avec le même DR, un seul est associé au groupe de gènes cas. L’équipe décrit également le leader, une séquence flanquant le CRISPR sur un côté et possédant un motif TATA, et qui sera plus tard identifié comme le promoteur pour la transcription du CRISPR (Jansen et al., 2002a ; Lillestol et al., 2006) (Figure 2).

Le séquençage de nouveaux génomes procaryotes conduit à découvrir la très grande diversité des gènes cas. Un travail de comparaison des protéines CAS présentes dans 200 génomes procaryotes complets permet à Haft et coll. (2005) de proposer une première classification constituée de 45 familles et de multiples sous-types. Cette classification continuera à évoluer avec l’analyse de nouveaux génomes séquencés (voir paragraphe « Diversité des systèmes CRISPR-Cas » ci-dessous).

thumbnail Figure 2

Représentation schématique d’un système CRISPR-Cas. Le groupe de gènes cas est suivi du leader représenté par une boîte marquée L et d’une succession de séquences DR (losanges noirs) séparés par les spacers (rectangles colorés).

Origine des spacers et première découverte d’un rôle des CRISPR

En 2005 sont publiées trois études montrant de manière indépendante que les spacers correspondent majoritairement à des séquences virales ou plasmidiques (Bolotin et al., 2005 ; Mojica et al., 2005 ; Pourcel et al., 2005). Deux des études in silico explorent les séquences génomiques procaryotes disponibles et réussissent à assigner une origine probable à 2 % des spacers par homologie de séquence (Bolotin et al., 2005 ; Mojica et al., 2005). Bolotin et coll. décrivent de plus la présence d’une courte séquence Pu-Py-A-A proche de la séquence homologue du spacer, appelée protospacer, et qui s’aligne avec la fin du DR (…ACAAC) chez Streptococcus thermophilus. Cette séquence sera à nouveau décrite en 2008 (Deveau et al., 2008), puis appelée Protospacer Adjacent Motif ou PAM en 2009 (Mojica et al., 2009). Dans la troisième étude, Pourcel et coll. analysent 108 souches clonales de Yersinia pestis, obtenues au cours d’une épidémie et montrent que le CRISPR-Cas acquiert de nouveaux spacers de manière polarisée (Figure 3). On peut, en comparant leur agencement, retracer une histoire évolutive de l’espèce bactérienne (Pourcel et al., 2005 ; Cui et al., 2008). Les nouveaux spacers ont principalement pour origine un prophage de Yersinia pestis.

Dans l’étude de Pourcel et coll., l’observation par analyse bioinformatique des séquences génomiques de souches de Streptococcus pyogenes (groupe A) permet de montrer que lorsqu’un spacer correspond à un phage, celui-ci n’est pas présent comme prophage dans le génome bactérien (Pourcel et al., 2005). De même, Bolotin et coll. font le lien entre le nombre de spacers correspondant à un phage dans un CRISPR et le niveau de résistance à ce phage (Bolotin et al., 2005).

Ces observations permettent de proposer pour la première fois l’hypothèse du rôle de CRISPR-Cas comme mécanisme de défense contre les phages, similaire à l’acquisition d’une immunité (Pourcel et al., 2005). Les articles de 2005 avaient ouvert la voie à l’étude fonctionnelle et mécanistique des systèmes CRISPR-Cas (Morange, 2015 ; Lander, 2016).

thumbnail Figure 3

Acquisition de nouveaux spacers dans le CRISPR-1 de Yersinia pestis. A : organisation du CRISPR dans 11 allèles. Les spacers S1 à S11 sont nouvellement acquis pendant l’épidémie. B : mécanisme d’insertion d’un nouveau spacer près du Leader (L).

Analyse du fonctionnement du système CRISPR-Cas

Barrangou et coll. (2007) sont les premiers à confirmer expérimentalement la prédiction faite en 2005 du rôle du système CRISPR-Cas. S. thermophilus utilisée comme ferment pour produire des yaourts possède trois CRISPR et deux groupes de gènes cas. Certaines parmi les souches résistant à une infection par un bactériophage possèdent dans le CRISPR, nommé CRISPR1, un nouveau spacer correspondant à une région du génome viral. En utilisant différents mutants, les chercheurs confirment le rôle du CRISPR dans la résistance et montrent le rôle de deux protéines Cas dans le fonctionnement de l’immunité. Cas7 est impliquée dans l’addition de nouveaux spacers, alors que Cas5 (ultérieurement renommée Cas9) est nécessaire à la résistance. Ces travaux enthousiasment la communauté scientifique et de nombreuses équipes entreprennent des recherches sur cette thématique.

Une première hypothèse émise sur le fonctionnement du système d’immunité avait été avancée du fait des similarités observées avec les systèmes d’interférence eucaryote médiés par les siRNA (small interfering RNA) et miRNA (microRNA) (Mak, 2005). L’existence de petits ARN dérivés du CRISPR (crRNA) et les similarités fonctionnelles entre certaines protéines Cas et des protéines de type dicer et slicer avaient conduit Makarova et coll. (2006) à proposer le nom piRNA pour prokaryotic interference RNA. Cependant, les études de Van de Oost et coll. sur le fonctionnement du système de Type I de E. coli montrent qu’il s’agit d’un mécanisme complètement différent (Brouns et al., 2008). Les chercheurs caractérisent un complexe de cinq protéines Cas, appelé Cascade, permettant la maturation de l’ARN précurseur CRISPR (pré-crRNA), et également la destruction de la cible en association avec la protéine Cas3. Ils montrent que le crRNA guide le complexe jusqu’à sa cible et que celle-ci n’est pas l’ARN comme précédemment supposé par certains mais l’ADN. Cette observation est également apportée par les résultats de Marraffini & Sontheimer (2008) sur l’inhibition du transfert horizontal d’un plasmide par le système CRISPR-Cas chez Staphylococcus epidermidis. Le travail décrit par Garneau et coll. en 2010 démontre que chez S. thermophilus, le système CRISPR-Cas (de type II) conduit à une coupure double-brin de l’ADN (Garneau et al., 2010).

Les trois fonctions principales nécessaires à l’établissement de l’immunité sont ainsi décrites (Figure 4) :

  • 1 : l’adaptation ou acquisition qui conduit à l’ajout d’un fragment d’ADN d’un génome invasif dans la structure CRISPR ;

  • 2 : l’expression qui se traduit notamment par la maturation du pré-crARN couvrant l’intégralité du CRISPR en petits ARN ou crARN contenant chacun la séquence d’un spacer ;

  • 3 : l’interférence ou immunité qui correspond au ciblage du génome étranger et à sa coupure par une endonucléase.

Une ou plusieurs protéines Cas sont nécessaires à chacune de ces fonctions et la cible est le plus souvent l’ADN mais peut également être une molécule d’ARN.

thumbnail Figure 4 Fonctionnement du système CRISPR-Cas. Trois fonctions sont communes à tous les systèmes :

– 1 : acquisition d’un nouveau spacer ;

– 2 : expression du système, notamment production des petits ARN ;
– 3 : interférence conduisant à la destruction de la cible.

Diversité des systèmes CRISPR-Cas

À ce jour l’analyse de l’ensemble des systèmes CRISPR-Cas des génomes entièrement séquencés permet de définir deux classes, six types et 33 sous-types (Koonin et al., 2017). Dans les Types I, III et IV qui constituent la classe 1, l’interférence est réalisée par un complexe de plusieurs protéines Cas (appelé Cascade dans le Type I) alors que pour les Types II, V et VI une grande protéine multifonctionnelle telle que Cas9 est généralement suffisante. Dans les systèmes de type II et V, un petit ARN supplémentaire appelé tracRNA est impliqué dans la maturation des crARN et l’adressage de l’endonucléase jusqu’à sa cible (Deltcheva et al., 2011 ; Jinek et al., 2012). Dans tous les systèmes, l’adaptation est effectuée par les protéines Cas1 et Cas2 avec parfois la protéine Cas4.

La caractérisation du rôle des Cas a permis de proposer leur utilisation comme outil pour la modification des génomes (Jinek et al., 2012). La protéine Cas9 est actuellement la plus utilisée mais d’autres protéines de systèmes de classe 2 montrent des propriétés prometteuses (Barrangou & Doudna, 2016).

Le mystère de l’adaptation

La nature des protéines Cas entrant en jeu dans la phase d’adaptation a été progressivement décrite mais deux questions se posent encore :

  • 1 : comment la cellule contrôle-t-elle le cycle d’un virus ou l’insertion d’un ADN étranger suffisamment longtemps pour permettre la mise en place de l’immunité ?

  • 2 : quels sont les signaux permettant au système CRISPR-Cas de distinguer l’ADN étranger de l’ADN cellulaire ?

Des éléments de réponse ont été apportés mais ils ne permettent pas à ce jour de répondre totalement à ces questions.

Au laboratoire, l’adaptation a été observée dans quelques rares espèces bactériennes. S. thermophilus semble utiliser CRISPR-Cas comme système de défense de manière prédominante dans plusieurs souches testées (Horvath et al., 2008). Cependant, l’expression du système chez S. thermophilus représenterait un coût élevé (fitness cost) pour la bactérie (Vale et al., 2015). Chez E. coli K12, le système est fonctionnel mais il est réprimé et nécessite la surexpression de Cas1 et Cas2 (Swarts et al., 2012). L’acquisition de nouveaux spacers a été observée chez Sulfolobus solfataricus uniquement en réponse à l’infection par un mélange de virus directement purifiés de l’environnement et contenant un plasmide conjugatif (Erdmann & Garrett, 2012). Enfin, chez Pseudomonas aeruginosa l’adaptation est active contre certains dérivés d’un phage tempéré, DMS3, proche du phage transposable de E. coli Mu (Cady et al., 2012). La facilitation est un terme proposé pour expliquer la possibilité de construire une immunité contre un virus avant que celui-ci ne détruise la cellule infectée (Abedon, 2011). Il faut pour ceci invoquer un rôle secondaire pour le système CRISPR-Cas dans la résistance aux virus, la résistance innée étant la première barrière à l’infection virale.

La séquence PAM localisée dans certains types CRISPR-Cas directement à côté du protospacer sur le génome d’origine est nécessaire à l’action des protéines Cas dans l’étape d’adaptation (Bolotin et al., 2005 ; Deveau et al., 2008 ; Mojica et al., 2009). C’est également cette séquence qui prévient l’autoimmunité car elle est nécessaire au fonctionnement de l’interférence (Stern et al., 2010). La majorité des protospacers identifiés à ce jour correspondent à des virus, plasmides, ou éléments transposables mais il existe un pourcentage non négligeable de protospacers correspondant à des séquences chromosomiques (Cui et al., 2008). Le système CRISPR-Cas pourrait donc, chez certains procaryotes, jouer un autre rôle. Chez différentes espèces bactériennes pathogènes, on a pu, par exemple, montrer un effet du système CRISPR-Cas dans le niveau de virulence (Zegans et al., 2009 ; Gunderson & Cianciotto, 2013 ; Louwen et al., 2013 ; Sampson et al., 2013 ; Zhang et al., 2013).

Origine et dispersion des systèmes CRISPR-Cas

Les structures CRISPR étant différentes des répétitions classiquement observées dans les génomes, des outils informatiques dédiés sont développés dès 2007, permettant d’explorer facilement les génomes. Les premiers programmes sont CRT (Bland et al., 2007), Piler-CR (Edgar, 2007) et CRISPRfinder (Grissa et al., 2007b). CRISPRdb, une base de données consultable sur internet permet un accès facile à ces séquences (Grissa et al., 2007a). Les analyses montrent que la majorité des archées et 48 % des bactéries possèdent au moins un CRISPR. Plus récemment de nouveaux algorithmes ont été produits permettant l’orientation du CRISPR et la recherche du leader (Alkhnbashi et al., 2016 ; Biswas et al., 2016). L’abondance de données de séquençage massif a suscité la création de nouveaux programmes tels que CRASS (Skennerton et al., 2013) et CRISPR detection (Ben-Bassat & Chor, 2016) permettant la recherche des CRISPR directement dans des fichiers de courtes lectures ou reads, tels que produits par les principales machines de séquençage. La recherche des protéines Cas et leur classification est facilitée par des outils comme MacSyfinder (Abby et al., 2014) et HMMCAS (Chai et al., 2017).

En alignant les protéines Cas1 de 54 génomes procaryotes, Haft et coll. (2005) ont remarqué que la phylogénie observée ne correspondait pas à celle des espèces. De plus, des systèmes CRISPR-Cas sont présents sur des plasmides et des îlots génomiques transférables, et des transposons sont fréquemment observés à proximité (Godde & Bickerton, 2006). Le transfert horizontal semble donc jouer un rôle important dans la dispersion des systèmes CRISPR-Cas chez les procaryotes. Leur origine reste inconnue mais le casposon, un transposon auto-synthétisé, pourrait représenter la forme primitive (Krupovic et al., 2014, 2017).

Analyse de microbiomes complexes

L’équipe de Jill Banfield a été la première à rechercher dans des données de métagénomes, la présence de structures CRISPR et à identifier, grâce à l’analyse des spacers, la présence simultanée des bactéries ou archées et de leurs virus (Andersson & Banfield, 2008 ; Tyson & Banfield, 2008). Ces études ont permis d’observer la dynamique des populations microbiennes dans différents environnements (Emerson et al., 2013). Cette approche a conduit à la découverte de nouveaux CRISPR et de nouveaux gènes Cas ainsi qu’à la reconstruction de la séquence de virus sources de protospacers (Rho et al., 2012). Burstein et coll. (2017) ont rapporté, par exemple, la présence d’un gène Cas9 chez une archée inconnue précédemment, alors qu’aucun système CRISPR-Cas de type II n’avait été décrit chez une archée.

Coévolution virus/hôte

Une mutation ou délétion dans le PAM ou dans le protospacer permet à un virus d’échapper à l’action d’un système CRISPR-Cas. Ce mécanisme est appelé évasion et il a été décrit dès les premières analyses du fonctionnement du système (Paez-Espino et al., 2015). De manière plus surprenante, plusieurs études ont permis de mettre en évidence des gènes anti-CRISPR chez des bactériophages. Chez P. aeruginosa, des phages proches du phage transposable Mu de E. coli possèdent de courts gènes codant pour des polypeptides capables de bloquer l’interférence d’un système de type I-E ou I-F (Bondy-Denomy et al., 2013 ; Pawluk et al., 2014). Plus récemment, ces auteurs ont détecté, par homologie de séquence, l’existence de protéines anti-Cas9 (Pawluk et al., 2016). La grande diversité des systèmes CRISPR-Cas pourrait être une réponse à l’adaptation des virus.

Une catégorie de phages de Vibrio cholerae possède un système CRISPR-Cas complet de type I-F. Certains spacers correspondent à des fragments d’un îlot chromosomique de 18 kb inhibant la réplication du phage, ce qui laisse supposer que le système CRISPR-Cas contrôle ce mécanisme de défense (Seed et al., 2013). Chez Clostridium difficile, des prophages portent un CRISPR possédant des spacers contre d’autres phages (Hargreaves et al., 2014).

Les CRISPR comme outil d’épidémiologie moléculaire

Les éléments CRISPR sont composés d’unités DR+spacers ajoutées séquentiellement après le leader (Pourcel et al., 2005). L’insertion à tout autre endroit est très rare et l’on observe donc une évolution de la structure dans le temps avec à une extrémité du CRISPR, les spacers les plus anciens, et à l’autre, du côté du leader, les traces des toutes dernières rencontres avec un ADN étranger. Le CRISPR peut perdre des unités DR+spacer par recombinaison interne et l’on observe parfois des duplications. L’analyse de souches d’une espèce possédant un CRISPR permet d’observer un polymorphisme dans le nombre et la nature des spacers et d’en déduire des relations phylogénétiques. En 1993, Groenen et coll. décrivent une nouvelle méthode permettant le génotypage de Mycobacterium tuberculosis et basée sur le polymorphisme d’un locus CRISPR, appelé alors DVR et observé depuis 1991 (Hermans et al., 1991 ; Groenen et al., 1993). Cette méthode appelée Spoligotypage sera appliquée au typage de dizaines de milliers de souches du complexe M. tuberculosis et apportera des éléments essentiels sur l’évolution du complexe (Filliol et al., 2003). Pour Yersinia pestis et plus largement Yersinia pseudotuberculosis, l’analyse du polymorphisme des CRISPR peut présenter un intérêt en épidémiologie moléculaire (Pourcel et al., 2005 ; Cui et al., 2008 ; Riehm et al., 2012 ; Koskela et al., 2015).

Conclusion

Les nombreuses études effectuées depuis la découverte d’un CRISPR en 1987 ont permis d’établir que le système CRISPR-Cas est un mécanisme d’immunité adaptative chez les procaryotes. Il semble cependant jouer un rôle essentiel principalement chez les archées et les bactéries hyperthermophiles qui possèdent peu de moyens de défense innés. Leur évolution et leur dispersion, ainsi que les interactions avec les virus, ont donné naissance à une très grande diversité. La découverte de ces systèmes, dont on ignorait totalement l’existence, est le résultat d’une recherche non guidée par l’hypothèse et rendue possible par la curiosité de chercheurs face à un élément biologique nouveau. Ces nouveaux naturalistes utilisent la bioinformatique pour puiser dans les données de génomique microbienne à la découverte d’espèces et de fonctions biologiques insoupçonnées.

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Citation de l’article : Pourcel, C. (2017). Historique de la découverte des systèmes CRISPR-Cas. Biologie Aujourd'hui, 211, 247-254

Liste des figures

thumbnail Figure 1

Diversité des séquences DR. Séquences du DR de six CRISPR appartenant à différentes espèces bactériennes. Le palindrome est surligné et la séquence 3’ terminale AAC/G est entourée.
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thumbnail Figure 2

Représentation schématique d’un système CRISPR-Cas. Le groupe de gènes cas est suivi du leader représenté par une boîte marquée L et d’une succession de séquences DR (losanges noirs) séparés par les spacers (rectangles colorés).
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thumbnail Figure 3

Acquisition de nouveaux spacers dans le CRISPR-1 de Yersinia pestis. A : organisation du CRISPR dans 11 allèles. Les spacers S1 à S11 sont nouvellement acquis pendant l’épidémie. B : mécanisme d’insertion d’un nouveau spacer près du Leader (L).
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thumbnail Figure 4 Fonctionnement du système CRISPR-Cas. Trois fonctions sont communes à tous les systèmes :

– 1 : acquisition d’un nouveau spacer ;

– 2 : expression du système, notamment production des petits ARN ;
– 3 : interférence conduisant à la destruction de la cible.
Dans le texte

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