Site actif de la glucocérébrosidase humaine : prédictions structurales et validations expérimentales

Active site of human glucocerebrosidase: structural features and mutagenesis studios

¹ INSERM U458, Hôpital Robert Debré, 48, Bd Sérurier, 75019 Paris.
² Systèmes Moléculaires et Biologie Structurale, Laboratoire de Minéralogie-Cristallographie, CNRS UMR 7590, T16, case 115, 4, place Jussieu, 75252 Paris Cedex 05.
³ INSERM U5I0, Centre d’Etudes Pharmaceutiques, 5, rue Jean-Baptiste Clément, 92296 Chatenay-Malabry.
⁴ Hybrigenics S. A., 180 avenue Daumesnil, 75012 Paris.

Résumé

La glucocérébrosidase (GC) est une enzyme lysosomale qui catalyse la dégradation du glucocérébroside en glucose et céramide, et dont le déficit enzymatique est responsable de la maladie de Gaucher. Cette glycosyl hydrolase (GH), non encore cristallisée, appartient au clan GH-A des GH qui regroupe de très nombreuses enzymes fonctionnant selon un mécanisme catalytique de conservation de la configuration anomérique du sucre. L’analyse comparative de l’ensemble des séquences protéiques du clan GH-A par la méthode de prédiction structurale « Hydrophobic Cluster Analysis » (HCA) a suggéré l’existence d’une structure de type tonneau (α/β)8 pour le domaine catalytique de toutes ces enzymes. Les deux acides aminés catalytiques (des résidus glutamates) directement impliqués dans l’hydrolyse de la liaison b-glucosidique du substrat ont été positionnés respectivement à l’extrémité C-terminale des brins β4 et β7 du tonneau catalytique. Un modèle structural de type tonneau (α/β)8 a ainsi été proposé pour le site catalytique de la GC et les acides glutamiques 235 et 340 de l’enzyme ont été potentiellement impliqués en tant que catalyseur acide-base (E235) et nucléophile (E340). Une validation des prédictions HCA a ensuite été recherchée par la mutagenèse substitutive de chaque glutamate du couple catalytique par un acide aminé ne pouvant pas participer à la réaction enzymatique (alanine). Des mutants E235A et E340A exprimés à l’aide de rétrovirus recombinants dans des cellules hétérologues dépourvues d’activité GC endogène se sont révélés totalement inactifs alors que leur biosynthèse et leur maturation étaient normales. Les résidus E235 et E340 ont ainsi été très fortement impliqués dans l’activité catalytique de la GC. Ces travaux ont illustré d’une manière plus générale, l’importance d’une complémentarité entre des approches de prédictions de structure et de vérifications expérimentales pour la caractérisation du site catalytique d’une enzyme impliquée dans une maladie génétique humaine.

Abstract

Gaucher disease is a lysosomal storage disorder caused by a deficiency in glucocerebrosidase which cleaves the β-glucosidic linkage of glucosylceramide, a normal intermediate in glycolipid metabolism. Glucocerebrosidase belongs to the clan GH-A of glycoside hydrolases, a large group of enzymes which function with retention of the anomeric configuration at the hydrolysis site. Accurate three-dimensional (3D) structure data for glucocerebrosidase should help to better understand the molecular bases of Gaucher disease. As such 3D structure data were not available, we used the two-dimensional hydrophobic cluster analysis (HCA) method to make structure predictions for the catalytic domains of clan GH-A glycoside hydrolases. We found that all the enzymes of clan GH-A may share a similar catalytic domain consisting of an (α/β)8 barrel with the critical acid/base and nucleophile residues located at the C-terminal ends of strands β4 and β7, respectively. In the case of glucocerebrosidase, Glu 235 was predicted to be the putative acid/base catalyst whereas the nucleophile was located at Glu 340. Next, in order to obtain experimental evidence supporting these HCA-based predictions, we used retroviral vectors to express, in murine null cells, E235A and E340A mutant proteins, in which alanine residues unable to participate in the enzymatic reaction replace the presumed critical glutamic acid residues. Both mutants were found to be catalytically inactive although they were correctly folded/processed and sorted to the lysosome. Thus, Glu 235 and Glu 340 do indeed play key roles in the active site of human glucocerebrosidase as predicted by the HCA analysis. In a broader perspective, our work points out that bioinformatics approaches may be highly useful for generating structure-function predictions based on sequence-structure interrelationships, especially in the context of a rapid increase in protein sequence information through genome sequencing.