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Numéro
Biologie Aujourd’hui
Volume 215, Numéro 1-2, 2021
Page(s) 1 - 23
DOI https://doi.org/10.1051/jbio/2021005
Publié en ligne 16 août 2021

© Société de Biologie, 2021

Introduction

Les protéines ont longtemps été considérées comme des constituants biologiques doués d’une grande stabilité. Cependant, dès 1942, la preuve de l’existence d’un état dynamique permanent entre leur synthèse et leur dégradation était apportée (Schoenheimer, 1942). Lors de la croissance cellulaire ou de la croissance des organismes, la biosynthèse des protéines excède leur dégradation alors que dans des conditions défavorables comme le manque de nutriments, la dégradation prend le dessus. Si d’importants efforts ont visé très tôt à élucider les mécanismes de la biosynthèse des protéines, les recherches sur leur dégradation ont été pendant longtemps beaucoup moins actives. Les travaux des années 1950–1970 ont permis d’établir que vitesse de synthèse et vitesse de dégradation des protéines étaient la clé de leur concentration cellulaire. Les protéines individuelles sont dégradées à des vitesses très différentes avec des demi-vies variant de quelques minutes (pour certaines protéines de régulation) à quelques jours (chaîne lourde de la myosine) ou quelques mois (hémoglobine des érythrocytes) (Lecker et al., 2006). La dégradation cellulaire des protéines est réalisée par le système ubiquitine-protéasome (SUP) et par différentes formes de protéasomes ainsi que par le système autophagie-lysosome. Ce dernier dégrade des protéines cytosoliques et celles de grands constituants cellulaires via des compartiments, les autophagosomes, qui fusionnent avec les lysosomes (Nakatogawa et al., 2009). En réponse à la dénutrition, la macroautophagie augmente pour recycler en nutriments les composants intracellulaires. Cependant, la majorité des protéines est dégradée par des complexes appelés collectivement « protéasomes » ou de manière encore plus simplifiée, « le protéasome » (Arrigo et al., 1988). Des complexes protéasomes analogues en taille, forme, composition en polypeptides et activités protéolytiques ont été identifiés dans les trois domaines du vivant (archébactéries, eucaryotes, vertébrés) (Tanaka et al., 1988 ; Goldberg, 2007). Une avancée majeure dans la connaissance des processus protéolytiques a été la découverte du rôle essentiel joué par une protéine très conservée de 76 acides aminés, l’ubiquitine, qui se lie par covalence au substrat protéique à dégrader selon un processus dépendant de l’ATP (Ciechanover et al., 1980 ; Hershko et al., 1980 ; Wilkinson et al., 1980). L’élucidation du rôle de cette conjugaison à l’ubiquitine, véritable marquage des protéines en vue de leur dégradation, a valu à Irwin Rose, Aaron Ciechanover et Avram Hershko l’attribution du prix Nobel de Chimie en 2004 (Ciechanover, 2005).

Chez les mammifères, le protéasome est donc un système protéolytique extra-lysosomal majeur, présent de manière ubiquitaire dans le noyau et le cytoplasme. Il peut représenter jusqu’à 1–2 % des protéines dans certains organes (foie, testicules). Machinerie de dégradation de plus de 80 % des protéines de courte et de longue durée de vie, il confère un caractère irréversible à certains processus biologiques. Il joue ainsi un rôle prépondérant dans le maintien de l’homéostasie des protéines et la régulation d’une très grande variété de processus physiologiques, donc dans la vie et la mort cellulaires. Cette multiplicité de rôles et l’implication dans de nombreuses pathologies expliquent la recherche très active d’une modulation de l’activité des protéasomes par des inhibiteurs (et aussi actuellement par des activateurs) en vue de traitements appropriés.

Cet article présente les multiples rôles physiologiques et physiopathologiques du protéasome, l’architecture modulaire des différents types de protéasome, leur mécanisme d’action, la dynamique du fonctionnement moléculaire du protéasome 26S lors de la dégradation de protéines et finalement, les succès thérapeutiques obtenus avec des inhibiteurs du protéasome constitutif. Cependant de nouveaux chapitres du domaine s’ouvrent actuellement. Ainsi, l’inhibition sélective de l’immunoprotéasome est porteuse d’un très grand potentiel clinique pour les désordres auto-immuns et l’inflammation. Les inhibiteurs du protéasome peuvent aussi constituer de nouveaux agents thérapeutiques pour la malaria et le contrôle de divers microorganismes. La découverte de nouveaux médicaments ne s’arrête donc pas à la recherche exclusive de modulateurs de l’activité du protéasome constitutif. Enfin, l’utilisation de la force destructive du protéasome pour dégrader sélectivement des protéines impliquées dans le développement de désordres pathologiques chez l’Homme fait l’objet d’un autre article dans ce même numéro de Biologie Aujourd’hui (Reboud-Ravaux, 2021). Ces nouvelles technologies dont celle des emblématiques chimères moléculaires PROTAC (PROteolysis TArgeting Chimeras) ouvrent une aire nouvelle pour la découverte de médicaments pouvant révolutionner une partie de la recherche pharmaceutique.

Les protéasomes, machineries de destruction des protéines

La cellule eucaryote contient des millions de molécules de protéasome qui vont assurer la dégradation des protéines dont on n’a plus besoin ou des protéines abîmées ou mal conformées. Cette dégradation peut se faire de manière dépendante ou indépendante de l’ubiquitine. Une schématisation de la voie dépendante de l’ubiquitine est présentée sur la figure 1. Elle comporte deux étapes successives hautement coordonnées : la conjugaison à l’ubiquitine de la protéine à éliminer suivie de sa dégradation en peptides de 2 à 22 acides aminés, catalysée par la particule catalytique (PC) 20S (720 Da) du protéasome constitutif 26S (2,4 MDa). Celui-ci est représenté ici avec deux particules régulatrices (PR) 19S. Les peptides libérés peuvent ensuite être dégradés en acides aminés par des peptidases cellulaires et être réutilisés dans la biosynthèse de protéines. Parmi ces peptidases, la tripeptidyl peptidase II (TPPII) est une peptidase à sérine cytosolique géante (∼ 6 MDa) commune chez les eucaryotes et douée d’une activité exopeptidasique. Des études structurales in situ montrent une association spatiale entre la TTPII et les protéasomes. Cette proximité physique facilite la coupure séquentielle des protéines par le protéasome, puis celle des peptides libérés par la TPPII (Fukada et al., 2017). Dans les conditions normales, 80 % des acides aminés sont produits selon cette voie permettant leur recyclage, seulement 20 % étant apportés par la nutrition. Le protéasome est donc nécessaire à l’homéostasie des acides aminés. Une partie des peptides (de 8 à 9 acides aminés) libérés par suite de l’action du protéasome 26S sont des antigènes pouvant être dirigés vers le complexe majeur d’histocompatibilité de classe I (CMH I).

Le processus d’attachement de l’ubiquitine à la protéine à dégrader utilise une cascade séquentielle de trois types d’enzymes : les enzymes d’activation de l’ubiquitine dépendant de l’ATP (E1), les enzymes de conjugaison à l’ubiquitine (E2) et les ubiquitine-protéine ligases E3 (Pickard & Eddins, 2004). Les enzymes E3 peuvent réagir spécifiquement avec une très grande variété de protéines-substrats. Plus de 600 d’entre elles sont trouvées dans le génome humain alors que seulement 2 E1 et environ 40 E2 ont été identifiées à ce jour. La reconnaissance des substrats protéiques par les E3 est essentielle pour aboutir à leur dégradation sélective. Elle est réalisée par une variété de motifs peptidiques bien définis, les N- et C-dégrons, découverts respectivement en 1986 et 2018 et situés au niveau des extrémités N- et C-terminales de la protéine à dégrader (Varshavsky, 1991, 2019). Cependant, l’ubiquitinylation des protéines n’est pas obligatoire pour une dégradation par le protéasome 26S (cas des protéines c-FOS et p21). Celui-ci peut aussi dégrader des protéines intrinsèquement désordonnées, oxydées ou mal conformées (Figure 1), même si ces dernières sont plutôt considérées comme essentiellement dégradées par le protéasome 20S, donc indépendamment de tout processus d’ubiquitinylation. Il en est de même pour la dégradation des protéines exogènes par l’immunoprotéasome induit par l’interféron gamma (IFN-γ) ou le facteur de nécrose tumoral TNF-α et qui est spécialisé dans la production de peptides antigéniques (Zerfas et al., 2020) (Figure 1). L’immunoprotéasome produit plus de peptides présentant un acide aminé hydrophobe en C-terminal, une caractéristique nécessaire des peptides antigéniques pour leur reconnaissance par le CMH I. Les fonctions de l’immunoprotéasome s’expliquent par des distinctions dans la spécificité de coupure des protéines et les régulations (Winter et al., 2017).

thumbnail Figure 1

Schématisation de la dégradation des protéines par les protéasomes 26S, 20S et l’immunoprotéasome. Le système ubquitine-protéasome (SUP) nécessite une action hautement coordonnée de ses composants lors de l’ubiquitinylation des protéines à dégrader, de la dé-ubiquitinylation et de la dégradation des protéines. La chaîne de poly-ubiquitine est liée via la lysine 48. La dégradation des protéines se fait sans ubiquitinylation préalable lorsqu’elle est catalysée par le protéasome 20S, l’immunoprotéasome et, dans certains cas, par le protéasome 26S.

Rôles physiologiques et physiopathologiques multiples des protéasomes

Le système ubiquitine-protéasome (UPS) est exprimé dans toutes les cellules eucaryotes. Via ce système, le protéasome 20S et l’immunoprotéasome, des actions essentielles de régulation sont exercées au niveau de quasiment toutes les voies biologiques du milieu cellulaire (Figure 2). Parmi ces multiples processus, on trouve la progression du cycle cellulaire, la division et la différenciation cellulaires, la transcription, la signalisation, le trafic cellulaire, l’apoptose, la réparation de l’ADN, les immunités innée et adaptative, la régulation de l’expression des gènes et la réponse au stress protéotoxique (Konstantinova et al., 2008). Les protéines mal conformées du réticulum endoplasmique (RE) sont rétrolocalisées dans le cytoplasme, polyubiquitinylées et dégradées par le protéasome selon un processus appelé dégradation de protéines associées au réticulum endoplasmique (ERAD, selon l’abréviation anglaise) (Smith et al., 2011 ; Wu & Rapoport, 2018 ; Wu et al., 2020). La dégradation des protéines par le protéasome est donc vitale pour toutes les cellules et tous les organismes. Cette complexité d’intervention dans la régulation de la dégradation des protéines pour une grande variété de processus physiologiques (Tomko & Hochstrasser, 2013) explique l’implication des protéasomes dans de nombreuses pathologies héritées ou acquises. En effet, le système UPS est fréquemment dérégulé ou défaillant dans des pathologies humaines comme les cancers, les pathologies inflammatoires, les désordres immunologiques et les neurodégénérescences (Schmidt & Finley, 2014 ; Tundo et al., 2020). À titre d’exemple, l’organisation du Golgi est régulée par la dégradation protéasomale (Eisenberg-Lerner et al., 2020). Plate-forme centrale pour le tri et la régulation du trafic des protéines cellulaires, l’assemblage correct du Golgi est crucial pour l’homéostasie cellulaire. Des perturbations dans sa structure ont été observées dans de nombreux désordres pathologiques allant de la neurodégénérescence au cancer. Ainsi la recherche très active d’inhibiteurs du protéasome et celle plus récente d’activateurs répondent à un souci d’applications thérapeutiques déjà couronné de succès pour les cancers hématologiques (Moreau et al., 2012).

thumbnail Figure 2

Résumé des multiples rôles physiologiques ou physiopathologiques joués par les protéasomes. Des exemples de substrats protéiques impliqués sont indiqués.

Architecture hiérarchisée et propriétés uniques des protéasomes

Les protéasomes sont constitués d’une PC de 28 sous-unités (720 kDa) en forme de tonneau dite 20S et qui est porteuse des sites actifs catalysant l’hydrolyse des liaisons peptidiques des protéines. Elle peut se lier à différents types de particules dites régulatrices ou PR.

Le protéasome 20S. On retrouve des particules de protéasome 20S chez les archébactéries, certains eucaryotes et les vertébrés (Tanaka et al., 1988 ; Goldberg, 2007 ; Kniepert & Groettrup, 2014). Elles présentent beaucoup d’homologie en termes d’architecture globale, de structure quaternaire et de géométrie des sites actifs (Figure 3). Une étape très importante a été l’élucidation de la structure tridimensionnelle des protéasomes 20S par cristallographie aux rayons X pour l’archébactérie Thermoplasma acidophilum (Löwe et al., 1995), puis la levure (Groll et al., 1997) et le bœuf (Unno et al., 2002). Les structures cristallographiques de la particule catalytique du protéasome constitutif (cPC) et de l’immunoprotéasome (iPC) de souris ont été obtenues en 2012 (Huber et al., 2012). Celles de Mycobacterium tuberculosis ont été élucidées en 2006 (Hu et al., 2006) et un peu plus tard celles de Plasmodium falciparum l’ont été par cryo-EM et analyse d’une particule unique (Li et al., 2016). Le 20S constitutif humain s’est révélé très difficile à cristalliser et sa première structure cristallographique ne date que de 2015 (Harshbarger et al., 2015). Les PC sont toutes constituées de deux anneaux de 7 sous-unités α enserrant deux anneaux de 7 sous-unités β. La co-cristallisation des PC avec des inhibiteurs covalents a permis de localiser les sites actifs. Chez les archébactéries, toutes les sous-unités α sont identiques et il en de même pour toutes les sous-unités β, ce qui conduit à 14 sites actifs identiques portés par chaque sous-unité β. Au contraire, chez les eucaryotes, toutes les sous-unités α comme toutes les sous-unités β sont distinctes. Seuls trois types de sous-unités β présentent un site actif. Elles sont distinguées par leur capacité d’hydrolyse de substrats peptidiques synthétiques fluorogéniques (Figure 4). Ces sites sont nommés par comparaison avec ceux d’enzymes montrant une activité protéolytique ou une spécificité similaire. Dans le protéasome constitutif, les deux sous-unités β1c sont dites de type caspase ou post-acide (PA), les deux sous-unités β2c sont dites de type tryptique (T-L) et les deux sous-unités β5c sont dites de type chymotryptique (ChT-L). En réalité, vis-à-vis de substrats protéiques naturels, tout type de liaison peptidique sera coupé in fine par le protéasome avec seulement quelques préférences. Dans les cellules hématopoiétiques et les cellules stimulées par l’interféron IFN-γ ou le facteur de nécrose tumoral TNF-α, les sous-unités protéolytiques actives β1c, β2c et β5c sont remplacées par de nouvelles sous-unités β1i [Low Molecular Mass Polypeptide (LMP2)], β2i (Multicatalytic Endopeptidase Complex-Like, MECL1) et β5i (LMP7), constituant ainsi la particule iCP de l’immunoprotéasome (Figure 3). À noter que la sous-unité β1i a une activité chymotryptique, ce qui la distingue de la sous-unité β1c (Kimura et al., 2015). Le thymoprotéasome possède les mêmes sous-unités β1i et β2i que le iCP mais une sous-unité β5t distincte de β5i (Murata et al., 2018). Dans le testicule, on trouve très représenté un protéasome spécial, le spermatoprotéasome, ce terme désignant un 20S associé à la particule régulatrice PA200. Il possède une sous-unité spécifique α4s et les mêmes sous-unités β que le protéasome constitutif (et non celles de l’immunoprotéasome comme suggéré précédemment) (Figure 3) (Uechi et al., 2014). Contrairement aux archées, les anneaux α et β des eucaryotes montrent un repliement identique dû à une grande similarité de séquence. L’analyse de la composition et de l’activité des différentes isoformes de protéasomes est réalisée in cellulo par l’utilisation de sondes fluorescentes particulières, mono- ou bifonctionnelles, créées chimiquement et susceptibles d’agir sélectivement sur un type de sous-unité (Verdoes et al., 2010 ; de Bruin et al., 2016 ; Zerfas & Trader, 2019).

Au cours de l’assemblage des sous-unités pour former l’édifice de 28 sous-unités des PC, seuls trois types de sous-unités β subissent une modification post-traductionnelle par autolyse avec libération d’un propeptide et formation d’une thréonine N-terminale accessible à l’intérieur des sites actifs (Huber & Groll, 2012). Cette Thr1 est impliquée dans le mécanisme catalytique classant le protéasome dans la catégorie des hydrolases à nucléophile N-terminal. Le protéasome a donc la particularité remarquable d’utiliser une thréonine en tant que catalyseur nucléophile. Autre particularité remarquable, les peptides résultant de la protéolyse des protéines ne sont libérés qu’en dessous de la taille de 22–23 acides aminés. La dégradation des protéines est donc itérative. Ce contrôle de la libération des produits par le CP s’accompagne d’un contrôle à l’accès des substrats. L’association CP-particule régulatrice est impliquée dans ce contrôle en provoquant l’ouverture du pore au niveau des sous-unités α (Figures 4 et 5) selon des mécanismes distincts en fonction de la nature de la particule régulatrice impliquée.

Les particules régulatrices. Le contrôle de l’ouverture du pore permettant l’accès de la protéine à dégrader à la chambre catalytique du 20S est assuré par différentes particules régulatrices qui jouent le rôle d’activateurs. La plus connue est la particule 19S (PA700). Ce constituant du protéasome 26S (Figure 5A) est un complexe dynamique dont la structure cristallographique n’a pu être obtenue. Des études génétiques et biochimiques combinées à la microscopie électronique (et plus récemment à la cryo-microscopie électronique, cryo-EM) et à des modélisations intégratives ont conduit, par reconstruction, à sa structure tridimensionnelle (Lander et al., 2012 ; Lasker et al., 2012 ; Chen et al., 2016 ; Dong et al., 2019). La particule 19S (19 sous-unités) est constituée de deux grands sous-complexes qui s’assemblent de manière indépendante : le couvercle formé de 9 sous-unités non-ATPases (Rpn 3, 5–9, 11, 12, 15) et la base constituée de 6 ATPases (Rpt 1–6) et 4 sous-unités non-ATPases (Rpn 1, 2, 10, 13) (Figures 5A et 5B). Les sous-unités Rpn 1, 10 et 13 permettent la fixation initiale de la chaîne de poly-ubiquitine liée au substrat à dégrader alors que la sous-unité Rpn11 est une dé-ubiquitinase (DUB) pouvant enlever l’ubiquitine (Figure 5B). La sous-unité Usp14 est aussi une DUB associée au 19S, comme la DUB Uch37 (ou UCHLl5) non représentée sur la figure 5A. Alors que Rpn11 est une métalloprotéase, Usp14 et Uch37 sont des protéases à cystéine. La fixation d’ATP sur l’anneau formé par les 6 ATPases et son hydrolyse induisent ensuite des changements conformationnels permettant le dépliement du substrat, l’ouverture du pore via les sous-unités α2, α3 et α4 (Figures 5B et 5C), puis la translocation du substrat vers la particule 20S. Il existe deux autres particules régulatrices chez les eucaryotes supérieurs, la particule 11S ou PA28 et la particule PA200 (Figure 6A). Contrairement au 19S, elles ne requièrent pas l’intervention d’ATP pour permettre l’ouverture du pore. Leur simple interaction avec un protéasome 20S provoque l’ouverture de celui-ci qui se trouve ainsi stabilisé (Whitby et al., 2000 ; Ortega et al., 2005). La particule PA200, par exemple, possède comme le 19S une extrémité C-terminale conservée de séquence Hb-Y-X (acide aminé hydrophobe-tyrosine-n’importe quel acide aminé). L’insertion de ces motifs dans des poches créées entre les sous-unités α provoque l’activation par ouverture du pore et ceci sans nécessité d’une rotation de ces sous-unités (consommatrice d’ATP) comme dans le cas du 19S (voir le paragraphe « Dynamique des interactions protéasome 26S-substrat »). Des expériences récentes de cryo-EM pour la particule humaine PA200 et son complexe avec la particule 20S fournissent des indications sur la régulation de l’ouverture du pore (Guan et al., 2020) Il existe trois sous-unités régulatrices du 11S : PA28α, β, γ. L’entité PA28α,β est un heptamère inductible localisé dans le cytoplasme alors que PA28γ est un homoheptamère exprimé de façon constitutive dans le noyau (Finley et al., 2016). Leur expression est augmentée en cas de stress oxydatif (Pickering & Davies, 2012). La particule PA200 jouerait un rôle notamment dans la spermatogenèse (Khor et al., 2006) et l’héritage mitochondrial (Sadre-Bazzaz et al., 2010). La particule α4s typique du spermatoprotéasome (Figure 3), contrairement à la particule α4, favoriserait l’association au PA200. Elle permettrait aussi le recrutement des sous-unités β1, β2 et β5 plutôt que celles de l’immunoprotéasome (Zhang et al., 2021). Le complexe ainsi formé est essentiel pour la réparation de l’ADN en métaphase I, la progression de la méiose et la fertilité masculine en favorisant, au moins partiellement, la dégradation des histones.

thumbnail Figure 3

Les protéasomes 20S des grands domaines du vivant. A noter l’analogie existant en termes de taille, forme, composition en polypeptides et activités protéolytiques. Les sept sous-unités α constituant chaque anneau α sont représentées en gris foncé sauf la sous-unité α4s typique du spermatoprotéasome qui est colorée en violet. Les sous-unités β porteuses d’un site actif sont colorées.

thumbnail Figure 4

Composition du protéasome 20S eucaryote constitutif. Coupe et agencement des sous-unités α et β⋅ Les sous-unités β comportant un site actif sont colorées en fonction de leur spécificité établie vis-à-vis des petits substrats synthétiques peptidiques. Les sites actifs sont localisés dans la chambre catalytique, elle-même entourée de deux chambres antérieures où les substrats peptidiques peuvent être stockés. La position du pore devant s’ouvrir lors de la translocation des substrats est indiquée. amc : 7-amino-4-méthyl-coumarine ; βNA, β-naphtylamine.

thumbnail Figure 5

Structure et fonctionnement du protéasome 26S. A. Schématisation de la particule 19S associée au protéasome 20S et formée de deux sous-complexes : le couvercle (Rpn 3, 5–9, 11, 12, 15) et la base (Rpt 1–6 {ATPases} et Rpn1, 2 et 13). Sont indiquées les sous-unités ayant une fonction particulière. En rose foncé, les sous-unités Rpn1, 10 et 13 capables de fixer la chaîne d’ubiquitine ; en orange, la dé-ubiquitinase Rpn11 (métalloprotéase) ; en rose clair, la dé-ubiquitinase Usp14 (cystéine protéase) nommée Ubp6 chez Saccharomyces cerevisiae. L’anneau formé par les 6 ATPases est coloré en bleu turquoise. B. Fonctionnement schématisé du protéasome 26S. Le substrat (en jaune) porteur d’une chaîne de poly-ubiquitine (en violet) est déplié à la suite des changements conformationnels coordonnés des ATPases et des sous-unités α. Les sites actifs des six sous-unités catalytiques sont représentés par des pastilles rouges. La chaîne protéique dépliée est alors injectée dans la chambre catalytique du 20S où elle subit une dégradation itérative. C. Schématisation du pore fermé du 20S (avant la complexation avec la particule régulatrice 19S) et du pore ouvert (après complexation). Avant complexation, les extrémités N-terminales des sous-unités α2, α3 et α4 obstruent le pore. Les changements conformationnels induits par le fonctionnement des six ATPases situées en regard des sous-unités α conduisent à une interaction entre les extrémités C-terminales des ATPases Rpt1et Rpt6 et les sous-unités de l’anneau α déclenchant l’ouverture du pore.

thumbnail Figure 6

Edifices moléculaires de protéasomes. A. Schématisation de la structure d’un protéasome 20S associé à des particules régulatrices PA28 (11S), 19S ou PA200. B. Les différentes associations 20S-particules régulatrices trouvées en milieu cellulaire.

Hétérogénéité des édifices moléculaires des protéasomes dans les cellules

Différentes associations entre la particule catalytique 20S et les différentes particules régulatrices sont retrouvées dans les cellules (Figures 6A et 6B). Dans les cellules HeLa par exemple, on trouve environ 41 % de protéasome 20S, c’est-à-dire non complexé, 15 % de 20S complexé à une ou deux particule(s) 19S (ce dernier est quelquefois nommé « protéasome 30S »), 24 % de protéasomes hybrides (20S complexé à une particule 11S et une particule 19S), 20 % d’immunoprotéasome (particule 20S de cette forme complexée à une ou deux particule(s) 11S) (Tanahashi et al., 2000). Ces proportions peuvent varier selon le type cellulaire comme cela a été vu pour la distribution du protéasome constitutif, de l’immunoprotéasome et de PA28 chez le rat (Noda et al., 2000). Des expériences in vitro de cryo-EM, qui permettent d’atteindre de plus hautes résolutions, ont montré que les préparations de protéasomes 26S sont clairement hétérogènes (Dong et al., 2019). La signification des différences de composition des protéasomes 26S dans les cellules demeure à ce jour largement incomprise. Les protéasomes atypiques qui contiennent à la fois la particule régulatrice PA200 et la sous-unité α4s, jouent un rôle important dans la fertilité masculine (Zhang et al., 2021). Par ailleurs, dans des neurones cultivés d’hippocampe, la cryo-EM montre que 80 % des molécules de protéasome 26S se trouvent dans la forme appelée parfois « inactive », c’est-à-dire sans substrat lié (Asano et al., 2015). Ce grand excès de protéasomes non liés à des substrats peut certainement être mobilisé dans des conditions de stress comme une privation de nutriments ou un jeûne prolongé (Collins & Goldberg, 2017).

Dynamique des interactions protéasome 26S-substrat

La cryo-EM a permis de déterminer la structure de l’état fondamental du protéasome 26S (résolution quasi atomique) et de la comparer à celle d’états conformationnels adoptés par l’enzyme complexée à un substrat protéique (résolution subnanométrique). Parmi ces travaux remarquables, on peut citer ceux obtenus avec la levure démontrant l’existence de deux (Luan et al., 2016), puis de quatre états conformationnels distincts conservés chez le rat et chez l’Homme (Bard et al., 2018). La continuité spatio-temporelle entre les différents évènements impliqués a été disséquée chez la levure (Ding et al., 2017, 2019 ; Eisele et al., 2018) et chez l’Homme (Chen et al., 2016 ; Dong et al., 2019 ; Chen et al., 2020), permettant de comprendre avec une grande précision les mouvements conformationnels coordonnés au sein du protéasome lors du passage de l’état fermé du pore à son état ouvert (Figure 5C). Cette ouverture est gérée par les interactions entre les sous-unités α localisées à la surface externe du 20S et les extrémités C-terminales des six sous-unités ATPases.

Une illustration concrète des expériences de cryo-EM permettant de suivre l’interaction dynamique d’un substrat protéique avec le protéasome 26S humain a été rapportée par Dong et al. (2019). En l’occurrence, le protéasome humain 26S a été traité pendant un temps court par un excès de substrat protéique en présence de 1 mM d’ATP avant l’addition de 1 mM d’ATPγS, puis la mise en route du processus de cryo-EM. L’ATPγS (lentement hydrolysé) entre en compétition avec l’ATP pour occuper le site actif des ATPases, ce qui arrête le processus engagé dans n’importe lequel des états conformationnels où se trouve l’édifice macromoléculaire et ceci, avant que la dégradation du substrat n’ait pu se faire. Ainsi, 2 700 000 particules de protéasome ont été étudiées dont 1 500 000 ont été trouvées associées à deux particules 19S. Après classement, sept états conformationnels distincts dans lesquels le substrat est engagé ont été identifiés : deux pour la reconnaissance initiale de l’ubiquitine par le 19S ; un pour un complexe compatible avec une dé-ubiquitinylation (la liaison isopeptidique liant le substrat à l’ubiquitine est visible et se trouve à proximité du site actif de la dé-ubiquitinase Rpn11) ; deux états successifs compatibles avec l’initiation de la translocation du substrat (le pore est encore fermé) ; enfin, deux consécutifs pour la translocation du substrat, le pore étant ouvert. Une continuité spatiotemporelle a ainsi été démontrée entre les processus de reconnaissance de la chaîne de poly-ubiquitine puis de dé-ubiquitinylation du substrat et la translocation de celui-ci impliquant des changements conformationnels induits par l’hydrolyse séquentielle de l’ATP par les 6 ATPases synchronisée à leur interaction avec des sous-unités α du 20S (Lander et al., 2012). Cette synchronisation permet des rotations des ATPases agissant comme une charnière : en interaction avec le substrat, elles permettent à celui-ci de progresser de manière unidirectionnelle dans l’anneau d’ATPases tout en favorisant son dépliement. L’obstruction initiale du pore est réalisée par les extrémités N-terminales des sous-unités α2, α3 et α4 (Figure 5C).

Les mécanismes par lesquels les protéines peuvent être ciblées et dégradées par le protéasome 20S en absence d’ubiquitine et de 19S sont moins bien connus. Quel que soit le mode de ciblage, la présence de régions non structurées est un prérequis pour l’initiation de la dégradation du substrat (Saeki, 2017 ; Yu & Matouschek, 2017). Ce dépliement de la structure protéique serait en soi une façon directe de contrôler la survenue de la dégradation.

Régulation de l’assemblage et de l’activité des protéasomes

Les cellules peuvent survivre en l’absence d’autophagie si les nutriments sont abondants, mutations ou délétions des gènes d’autophagie ne compromettant pas la viabilité cellulaire. Ce n’est pas le cas pour les gènes codant les sous-unités du protéasome. L’activité de celui-ci doit être très finement régulée. Il dégrade en effet des milliers de protéines de durée de vie courte, de protéines régulatrices, de protéines endommagées ou mal conformées, ce qui lui permet d’assurer la régulation d’un grand nombre de fonctions cellulaires (Figure 2). Le fonctionnement du SUP demeure donc important même lorsque les nutriments sont abondants. La protéolyse étant irréversible, les conséquences cellulaires seraient sévères si les protéasomes détruisaient les protéines de manière non sélective ou s’ils fonctionnaient de manière non itérative en libérant des polypeptides partiellement dégradés. Deux types de signaux indiquent que les protéines doivent être dégradées : (a) leur ubiquitinylation, habituellement sous la forme de chaînes d’ubiquitine liées à la Lys-48 (Finley, 2009 ; Komander & Rape, 2012 ; Saeki, 2017 ; Yu & Matouschek, 2017) ; (b) la présence dans leur conformation de régions non structurées qui sont des initiateurs de dégradation (Prakash et al., 2004 ; Inobe & Matouschek, 2014).

Depuis la découverte du rôle critique de l’ubiquitine dans le renouvellement des protéines et celle du protéasome 26S dans la dégradation de protéines conjuguées à l’ubiquitine, on a fait au départ l’hypothèse de vitesses de protéolyse régulées uniquement par l’ubiquitinylation. On sait maintenant que l’ubiquitinylation et même l’association des protéines ubiquitinylées au protéasome ne conduisent pas nécessairement à leur dégradation (Finley, 2009 ; Inobe & Matouschek 2014 ; Harrigan et al., 2018). Il existe ce que Collins & Goldberg (2017) ont appelé une « logique du protéasome 26S » qui va déterminer si une protéine ubiquitinylée subira une dégradation ou survivra intacte. Dans une étape initiale réversible, il y a une fixation très affine de la chaîne d’ubiquitine sur les récepteurs à l’ubiquitine du 19S (Rpn1, Rpn10, Rpn13), puis, avec une plus forte affinité, sur la sous-unité Usp14 (protéase à cystéine), ce qui induit des changements conformationnels du 19S (Kim & Goldberg, 2017). La dé-ubiquitinase Usp14 (ainsi que Uch37) agirait avant l’engagement vers la protéolyse par compétition cinétique entre la dé-ubiquitinylation conduisant à la survie cellulaire et l’activation allostérique due aux changements conformationnels qu’elle induit et qui augmentent la probabilité de capture du substrat par les ATPases et ainsi la translocation dans le 20S (Collins & Goldberg, 2017 ; de Poot et al., 2017 ; Reboud-Ravaux, 2021). La fixation à l’Usp14 de substrats ubquitinylés expose aussi le site actif de la Rpn11 et augmente son activité catalytique (Bashore et al., 2015). L’activité de ces deux dé-ubiquitinases est donc coordonnée en empêchant une dé-ubiquitylation prématurée par la Rpn11. Plus récemment, Kim & Goldberg (2018) ont démontré que le domaine ubiquitin-like de l’Usp14 peut stimuler l’activation des protéasomes par les protéines ubiquitinylées. Des inhibiteurs de Usp14 augmentent la probabilité de dégradation du substrat (Lee et al., 2010, 2016). L’action de la sous-unité Usp14 est très complexe d’autant plus qu’Usp14 contient, outre son domaine catalytique C-terminal, un domaine N-terminal ubiquitin-like (UBL). Ce domaine UBL peut en lui-même stimuler plusieurs fonctions du protéasome.

La présence de régions mal structurées dans les protéines facilite leur élimination. Les protéines ont tendance à devenir plus stables lorsque des complexes multimériques se forment, ce qui, en minimisant des régions ou des domaines moins structurés, peut les protéger de la dégradation protéasomale (McShane et al., 2016). De même l’enzyme DHFR est rapidement dégradée par le protéasome in vitro et in cellulo alors que, complexée à son inhibiteur méthotrexate hautement affin, elle ne l’est plus (Thrower et al., 2000). La situation est encore rendue plus complexe par la présence de « protéines navettes » contenant un domaine ubiquitine et un domaine associé à l’ubiquitine qui leur permettent de se lier simultanément à des conjugués d’ubiquitine et au 26S (Shi et al., 2016).

Outre ce ciblage sélectif des protéines vers le protéasome, les cellules disposent d’une autre voie pour ajuster la dégradation protéasomale à leur besoin : la régulation de l’abondance de protéasome via une expression coordonnée des sous-unités du protéasome et de leur assemblage par des chaperonnes. Les mécanismes complexes de l’assemblage de la particule PC et de la particule régulatrice 19S ne seront qu’évoqués ici. La revue de Rousseau & Bertolotti (2018) explique de manière claire les trois étapes de l’assemblage du PC (formation de l’anneau α, de l’anneau β et dimérisation des demi-protéasomes avec maturation) ainsi que la formation multi-étapes du 19S avec les assemblages indépendants des deux grands sous-complexes (base et couvercle). L’assemblage de la base est assisté par cinq chaperonnes alors que celui du couvercle s’effectue seul ou sous l’action de facteurs facilitants encore non découverts. L’assemblage du protéasome est donc un processus complexe très régulé, intégré dans le métabolisme cellulaire via le complexe régulateur du stress et de la croissance cellulaire TORC1 (Hara et al., 2002 ; Kim et al., 2002).

La vitesse de dégradation des protéines par le système ubiquitine-protéasome dépend également du degré d’activité du protéasome, qui peut être régulé par la phosphorylation de certaines de ses sous-unités (VerPlanck & Goldberg, 2018). Bien que plus de 300 sites de phosphorylation de sous-unités du protéasome aient été détectés (Guo et al., 2017), l’influence de seulement deux protéines kinases a été clairement démontrée. Elles augmentent la capacité du protéasome à dégrader les protéines ubiquitinylées et à promouvoir la dégradation intracellulaire des protéines. Il s’agit de la protéine kinase A (PKA) qui, après une augmentation du cAMP, phosphoryle la sous-unité Rpn6 du19S (Lokireddy et al., 2015) et de la kinase DYRK2 qui phosphoryle la sous-unité ATPase Rpt3 de ce même19S (Guo et al., 2016). L’idée simple de l’ubiquitinylation comme unique signal de mort des protéines est donc bien obsolète. L’activation du protéasome in vivo via la voie cAMP-PKA apparaît comme une réponse cellulaire commune à divers stimuli endocrines (glucagon, épinéphrine, forskoline) (VerPlanck et al., 2019). Ce processus d’élimination rapide de protéines régulatrices, en éventuelle synergie avec une augmentation de l’expression de nouveaux gènes, peut donc aider les cellules à adapter la composition des protéines à de nouvelles conditions physiologiques. Ainsi, une augmentation de l’activité des protéasomes et de la phosphorylation de la sous-unité Rpn6 est observée dans des cœurs traités à l’épinéphrine, dans des muscles lors de l’exercice musculaire chez l’Homme ainsi que dans des muscles murins excités électriquement. Il en résulte un accroissement rapide de la capacité des tissus cibles à dégrader les protéines régulatrices préexistantes et les protéines mal conformées comme celles endommagées par de l’exercice ou celles impliquées dans des maladies dégénératives, notamment les protéines Tau mutantes (Lokireddy et al., 2015 ; Myeku et al., 2016).

Propriétés catalytiques uniques des protéasomes

Les protéasomes ont l’originalité d’être des protéases à thréonine. La thréonine catalytique étant en position 1, elle intervient de deux façons dans le processus hydrolytique : (a) par sa fonction hydroxyle, attaque nucléophile du carbonyle de la liaison peptidique scissile ; (b) par son groupe α-aminé, catalyse générale acide lors de la coupure du premier intermédiaire tétraédrique (IT1) conduisant à la libération du premier produit, puis catalyse générale basique facilitant l’attaque de la molécule d’eau sur l’acyl-enzyme (Figure 7A) (Huber et al., 2016). Comme lors de la catalyse de l’hydrolyse des liaisons peptidiques par les protéases à sérine, la libération des deux produits résultant de l’hydrolyse de la liaison peptidique sécable est séquentielle avec formation d’un intermédiaire lié par covalence à l’enzyme, l’acyl-enzyme. Sa formation comme sa coupure nécessitent la formation d’un intermédiaire tétraédrique (IT1, puis IT2) dont l’oxygène chargé négativement est stabilisé par une liaison hydrogène impliquant le groupe NH de la Gly47 dans ce que l’on nomme le trou oxyanion. Le groupe ε-aminé de la Lys33 exacerbe la nucléophilie de la fonction alcool de la Thr1 par arrachement de son proton. La charge positive ainsi acquise de la Lys33 est stabilisée par deux liaisons hydrogène impliquant un atome d’oxygène des résidus Arg19 et Asp17 (non représentés sur la Figure 7A). Lors de la biogenèse du protéasome, les sous-unités β1, β2 et β5 possèdent à leur extrémité N-terminale un propeptide qui sera éliminé de manière autocatalytique après la formation des anneaux β. C’est encore la Lys33 qui initie le processus d’attaque nucléophile du propeptide en arrachant un proton au groupe hydroxyle de la Thr1 (Huber et al., 2016). Ce processus d’activation autocatalytique permet la libération des propeptides et l’obtention de la particule 20S pleinement active présentant la thréonine catalytique en position 1 dans les trois types de sites actifs.

Comme habituellement pour les autres protéases, une fixation étendue des substrats protéiques dans les sites actifs des protéasomes est observée. Chaque site actif des sous-unités β1, β2 et β5 apparaît comme une longue crevasse constituée de sous-sites (S1…Sn et S’1…S’n) localisés de part et d’autre du site catalytique porteur de la Thr1 (nomenclature de Schechter & Berger, 1967). Les positions P des acides aminés du substrat sont numérotées à partir de son point de coupure et ont la même numérotation que les sous-sites qu’ils occupent (Figure 7B). Les données cristallographiques (Huber et al., 2012) et l’analyse de la fixation d’une grande variété d’inhibiteurs ont permis d’identifier les différences structurales entre les sous-sites de fixation des substrats pour le cPC et pour l’iPC. Ces données sont importantes pour la conception rationnelle d’inhibiteurs. Le sous-site de reconnaissance S1 de l’immunoprotéasome est plus grand que celui du protéasome constitutif car la Met45, présente à ce niveau, adopte une conformation différente ; le sous-site S3 accommode de petits groupes polaires et non de grands groupes apolaires comme le 20S constitutif. La poche S4 de l’immunoprotéasome a la particularité de présenter une cystéine en position 48.

thumbnail Figure 7

Hydrolyse des protéines catalysée par le protéasome. A. Mécanisme proposé pour l’hydrolyse des liaisons peptidiques des protéines. La thréonine catalytique Thr1 est représentée en bleu. Un premier intermédiaire tétraédrique IT1 est formé après l’attaque du carbonyle de la liaison scissile par la fonction hydroxyle de la Thr1 ce qui conduit à la formation d’une acyl-enzyme. Un deuxième intermédiaire tétraédrique IT2 résulte de l’attaque du carbonyle de l’acyl-enzyme par une molécule d’eau. Ces deux intermédiaires chargés négativement sont stabilisés via la formation d’une liaison hydrogène entre leur oxygène chargé négativement et le groupe NH de la Gly47 dans le trou oxyanion. B. Représentation schématisée selon Schechter & Berger (1967) de la crevasse du site actif d’un protéasome accommodant la séquence d’une protéine en vue de son hydrolyse. La Thr1 est indiquée ainsi que la liaison sécable. Les acides aminés sont représentés par des rectangles et leurs chaînes latérales sont numérotées respectivement P1-Pn et P1’et Pn’ selon que les acides aminés sont en amont ou en aval de la liaison sécable. Les chaînes latérales sont reconnues respectivement par les sous-sites de spécificité S1-Sn et S1’-Sn’. Le sous-site S4 de l’iPC présente une cystéine en position 48. Les sous-sites accommodant les chaînes latérales des acides aminés sont représentés par des croissants gris.

Myélome multiple et inhibiteurs du protéasome

Depuis 2003, l’utilisation du bortezomib, un inhibiteur du protéasome a considérablement amélioré le traitement et la survie des malades atteints de myélome multiple et de lymphone du manteau (Figure 8A). Deux autres inhibiteurs ont par la suite été mis sur le marché, le carfilzomib (2012) et l’ixazomib (2016) pour les mêmes indications (Figure 8A). Les inhibiteurs du protéasome sont donc devenus un des piliers de la thérapie du myélome multiple, pathologie représentant 1 % des cancers totaux. Ces inhibiteurs font partie des nombreux agents thérapeutiques nouvellement validés à côté des agents immunomodulateurs IMiD (lénalidomide et pomalidomide, analogues de la thalidomide) et d’anticorps monoclonaux (MoAB) (Nadeem et al., 2020). Mais malgré ces progrès, cette maladie demeure encore incurable.

L’exceptionnelle sensibilité des cellules plasmatiques de myélome multiple aux inhibiteurs de protéasome est reliée à leur grande dépendance vis-à-vis du système de contrôle de qualité des protéines. Cela repose en grande partie sur les différents mécanismes qui constituent l’ERAD. Les protéines sécrétoires et membranaires mal conformées passent du réticulum endoplasmique au cytosol où elles sont dégradées par le protéasome (Smith et al., 2011). Le renouvellement des immunoglobulines anormales est très élevé. La présence d’inhibiteurs du protéasome augmentant le nombre de protéines à dégrader, l’accumulation de protéines mal conformées ou dépliées conduit à un stress du réticulum endoplasmique et éventuellement à la mort cellulaire. Du fait de l’implication du protéasome dans un grand nombre de processus biologiques, son inhibition a aussi de multiples effets sur la toxicité cellulaire : diminution de la prolifération cellulaire et induction d’apoptose, arrêt du cycle cellulaire, déficit des mécanismes de réparation de l’ADN et altération du métabolisme cellulaire. Cette inhibition affecte à la fois les constituants cellulaires et non cellulaires du micro-environnement de l’hôte en diminuant l’expression de plusieurs molécules d’adhésion comme ICAM1 et VCAM1, en perturbant l’interaction de cellules de myélome multiple avec les cellules accessoires de la moelle osseuse, en inhibant la sécrétion de cytokines (comme IL6, VEGF, IGF-1) et l’angiogenèse, et en modifiant le renouvellement de l’os et l’activité des ostéoclastes (Kubiczkova et al., 2014 ; Nunez & Annuziata, 2017 ; Nadeem et al., 2020). La plupart de ces effets reposent, au moins en partie, sur l’inhibition directe de la voie NF-κB, une des voies majeures de survie et de prolifération des cellules de myélome multiple. Ainsi, le bortezomib empêche la dégradation de l’inhibiteur IκB, ce qui augmente l’efficacité thérapeutique des traitements conventionnels comme la dexaméthasone et le lénalidomide (Hideshima et al., 2001). La dégradation de régulateurs clés du cycle cellulaire comme p53 (anti-apoptotique) est empêchée. L’accumulation de protéines mal conformées coïncide également avec l’induction d’espèces réactives de l’oxygène (ROS). L’activation de la voie JNK conduit à celle des caspases, comme les caspases 3 et 7, et oriente vers l’apoptose (Pérez-Galan et al., 2006).

Le succès thérapeutique des inhibiteurs du protéasome dans les cancers hématologiques a conduit à rechercher de nouvelles indications thérapeutiques. Des essais cliniques de combinaisons thérapeutiques avec d’autres types de molécules sont conduits notamment pour les leucémies, les lymphomes, les tumeurs solides, les maladies auto-immunes et la réaction du greffon contre l’hôte.

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Structure chimique des inhibiteurs du protéasome constitutif et de l’immunoprotéasome utilisés en clinique ou en préclinique et leur mécanisme d’action. A. Inhibiteurs du protéasome constitutif : bortezomib, carfilzomib et ixazomib sont utilisés en clinique. Les modes d’administration sont intraveineux (pour le carfilzomib, Kyprolis®, Proteolyx Inc.), ou, préférentiellement, sous-cutané (pour le bortezomib, Velcade®, Millenium Pharmaceuticals) ou per os (pour la prodrogue MNL2238 qui, par hydrolyse, libérera l’ixazomib, Ninlaro®, Takeda). Le marizomib et l’oprozomib sont des molécules en étude clinique développées respectivement par Nereus et ONYX Pharmaceuticals. Les sous-sites de sélectivité liant les inhibiteurs sont indiqués. Les boronates conduisent à des inhibitions lentement réversibles alors que les époxycétones et le marizomib entraînent des inhibitions irréversibles. Les époxycétones conduisent à un adduit hexagonal 1,4-morpholine avec le protéasome de levure tandis qu’un adduit cyclique heptagonal 1,4-oxazepane a été mis en évidence avec le protéasome 20S humain. B. Mécanismes d’action sur les protéasomes des boronates (bortezomib, ixazomib), des époxycétones (carfilzomib, oprozomib, ONX-0914 et KZR-616) et du marizomib. C. Inhibiteurs actuellement en étude clinique et agissant sélectivement sur l’immunoprotéasome.

Les différents inhibiteurs du protéasome

Au cours des deux dernières décennies, une recherche très active d’inhibiteurs sélectifs du protéasome s’est mise en place aussi bien aux niveaux universitaires qu’industriels en vue d’obtenir d’une part des outils de recherche, d’autre part des médicaments. Elle a abouti à une grande variété d’inhibiteurs qu’ils soient d’origine naturelle, issus de synthèses organiques ou de criblage de collections de molécules patrimoniales (Borrissenko & Groll, 2007 ; Genin et al., 2010 ; Gräwert & Groll, 2012 ; Huber & Groll, 2012). Ce foisonnement de molécules a permis de passer des aldéhydes peptidiques (premiers inhibiteurs analogues d’inhibiteurs de protéases à sérine dont le bien connu et peu sélectif MG132) à des inhibiteurs du protéasome de structures diverses utilisés aujourd’hui en oncologie (Cromm & Crews, 2017 ; Manasanch & Orlowski, 2017 ; Sherman & Li, 2020 ; Tundo et al., 2020).

Inhibiteurs en clinique et pré-clinique. Comme déjà brièvement souligné plus haut, la recherche d’inhibiteurs du protéasome susceptibles de traiter la cachexie a abouti en fait au premier inhibiteur de protéasome approuvé en 2003 par la FDA dans le traitement du myélome multiple récidivant ou réfractaire, puis en 2006 dans celui du lymphome du manteau (Kane et al., 2006). Ce premier inhibiteur utilisé en thérapeutique, fruit d’une recherche translationnelle, est le bortezomib (Velcade®, PS-341) (Figure 8A). Ce boronate dipeptidique cible préférentiellement les sous-unités β5c et β5i avec des valeurs d’IC50 respectives de 7 et 4 nM et crée un adduit lentement réversible avec la Thr1 (Figure 8B ; Tableau 1). Il déclenche des effets secondaires importants (neuropathie périphérique, thrombocytopénie, désordres gastro-intestinaux), qui peuvent cependant être minimisés si une administration sous-cutanée remplace l’administration classique intraveineuse (Moreau et al., 2011). Des inhibiteurs de deuxième génération ont ensuite été mis au point. L’un d’eux, le carfilzomib (Kyprolis®), approuvé par la FDA en 2012, est un inhibiteur synthétique irréversible analogue de l’époxomicine, molécule anticancéreuse naturelle pour laquelle des perturbations du système immunitaire avaient été observées et attribuées à l’inhibition du protéasome (Figure 8A). Carfilzomib et époxomicine sont porteurs d’une fonction époxycétone typique, responsable de la sélectivité d’action sur le protéasome. Ils conduisent en effet à des adduits stables avec liens covalents impliquant à la fois la fonction alcool et la fonction α-aminée de la Thr1. Ces adduits ont été identifiés par cristallographie pour la levure (Groll et al., 2000) et l’Homme (Schrader et al., 2016) (Figure 8B). Les effets secondaires du carfilzomib sont moins importants que ceux du bortezomib. Il inhibe lui aussi quasi exclusivement les activités des sous-unités β5c et β5i (IC50 de 6 et 33 nM, respectivement) (Tableau 1). Administré par voie intraveineuse, son temps de demi-vie est court (30 min environ). Le troisième inhibiteur du protéasome utilisé en thérapeutique dans le myélome multiple est un boronate peptidique, l’ixazomib (Ninlaro®) (Figures 8A et 8B), qui a l’avantage de pouvoir être administré oralement. Il est libéré sous forme de boronate actif par hydrolyse rapide de la prodrogue MLN9708 (Kupperman et al., 2010). Son temps de demi-vie est un peu plus court que celui du bortezomib. Il inhibe les activités β5c (IC50 de 3,4 nM) et β1c (IC50 de 31 nM) sans effet sur la sous-unité β5i. Deux inhibiteurs du protéasome sont actuellement en phase d’étude clinique : l’époxycétone oprozomib (Ninlaro®), une époxycétone presque aussi puissante que le carfilzomib avec des IC50 de 36 nM (β5c) et 82 nM (β5i) (Chauhan et al., 2010) et un produit naturel, la salinosporamide A, issue de la bactérie océanique Salinospora CNC-392 et connue sous le nom de marizomib (Figure 8A). Il s’agit du seul inhibiteur non peptidique de faible poids moléculaire possédant des propriétés anticancéreuses. De courte durée de vie (< 15 min), il inhibe de manière irréversible le protéasome : IC50 de 3,4 nM (β5c), de 26 nM (β2c) et 330 nM (β1c) (Figure 8B) (Groll et al., 2006b). Il est aussi en étude clinique pour traiter le glioblastome.

Résistances. Des résistances acquises au bortezomib ont été observées. Par ailleurs, certains types cellulaires peuvent également l’être au carfilzomib, mais de manière inhérente (Lee et al., 2019). Une hyperactivation des activités tryptique (β2) et de type caspase (β1) peut compenser l’inhibition du site chymotryptique (β5). Des nouveaux inhibiteurs tels que le marizomib qui bloquent irréversiblement les trois activités sont susceptibles d’empêcher cette compensation. Des mutations dans la sous-unité β5 peuvent également être responsables de cette résistance en restreignant l’accès des inhibiteurs au site actif (Huber et al., 2015). Il a été démontré récemment que l’immunoprotéasome peut jouer un rôle important dans la progression de cancers. Il est en effet surexprimé par rapport au protéasome constitutif dans le myélome multiple, le cancer de la prostate et certaines formes de cancers du sein, ce qui facilite la survie de la cellule cancéreuse. La résistance aux inhibiteurs du protéasome constitutif est aussi liée à cette surexpression. L’immunoprotéasome est exprimé en permanence dans le système immunitaire (cellules T, B, thymiques ; macrophages). Il est fortement induit par l’INF-γ et le TNF-α dans quasiment toutes les cellules sauf dans le cerveau où il est confiné à la microglie et aux leucocytes invasifs. Lors d’infections virales, bactériennes ou fungiques, il remplace 90 % du protéasome constitutif. Ceci explique la recherche actuelle très active d’inhibiteurs sélectifs de l’immunoprotéasome pour élucider ses différents rôles et analyser le potentiel de son inhibition en thérapeutique (Sherman & Li, 2020 ; Zerfas et al., 2020).

Inhibiteurs de l’immunoprotéasome. L’immunoprotéasome a été associé non seulement à certains types de cancer mais aussi au développement et à la progression des maladies neurodégénératives, à des désordres de l’auto-immunité et à l’inflammation (Figure 9) (Groettrup et al., 2010 ; Zerfas et al., 2020). Au niveau cellulaire, deux voies majeures sont impliquées, la sécrétion de cytokines et la différenciation de cellules T helper. Ceci suggère que l’immunoprotéasome est une cible thérapeutique dans le traitement des pathologies inflammatoires. Pour améliorer les profils pharmacologiques et toxicologiques, de nouveaux inhibiteurs présentant une sélectivité améliorée pour l’immunoprotéasome ont été développés pour diverses pathologies. Les différences structurales observées chez la souris entre la particule iPC et la particule cPC ont été exploitées (Figure 7B) (Huber et al., 2012). Des inhibiteurs sélectifs des sous-unités β1i, β2i et β5i ont été développés (Zerfas et al., 2020). Parmi eux, la molécule PR-957, rebaptisée plus tard ONX 0914, est un inhibiteur époxycétone de la sous-unité β5i de l’iPR (IC50 de 28 nM) avec une sélectivité augmentée d’un facteur 10 par rapport à β5c (Figure 8C). Sa cocristallisation avec l’iPR a permis de comprendre les bases structurales de cette sélectivité : elle est due à une différence de positionnement de la Met45 dans les deux types de protéasomes (Kniepert & Groettrup, 2014 ; Xin et al., 2019). La comparaison de l’effet de l’ONX-0914 et d’autres inhibiteurs à celui d’inhibiteurs du cPC a permis de déterminer le bénéfice des inhibiteurs de l’iPC pour combattre les résistances observées avec les inhibiteurs du cPC. Ces études ont été facilitées par le développement de nouveaux outils ou nouvelles techniques d’essais, notamment in cellulo (Zerfas et al., 2020). Si les inhibiteurs du protéasome peuvent constituer une nouvelle classe d’anticancéreux en conjonction avec d’autres inhibiteurs du protéasome, ils ont également un grand potentiel pour le traitement des maladies auto-immunes. La molécule KZR-616 (Figure 8C) a une meilleure solubilité que la molécule ONX-0914 et est quarante fois plus efficace. Elle est entrée en phase clinique afin de démontrer son potentiel dans le traitement des désordres de l’auto-immunité (lupus érythémateux) et de maladies inflammatoires (arthrite rhumatoïde) (Johnson et al., 2018). Les travaux de l’équipe de Groettrup (Université de Constance) ont montré qu’un traitement prolongé par l’ONX-0914 conduit à l’inhibition à la fois des sous-unités β5i et β1i. Un effet synergique entre l’ONX-0914 et des inhibiteurs sélectifs de β1i (PRN116, LU-001i or ML604440) a démontré que la co-inhibition de β5i et β1i était nécessaire pour bloquer l’auto-immunité (Basler et al., 2018). La molécule ONX 0914 semble aussi d’intérêt pour le traitement de la myocardite virale aiguë (Althof et al., 2018). En empêchant l’activation des cellules B et T, les inhibiteurs de l’immunoprotéasome ont donc un véritable potentiel thérapeutique pour une large gamme de pathologies comme les désordres auto-immuns, le rejet de greffes, les cancers et les dommages tissulaires associés aux infections virales (Schmidt et al., 2018).

Développement d’inhibiteurs non covalents. Tous les inhibiteurs du protéasome constitutif utilisés en thérapeutique et ceux actuellement en clinique sont des entités électrophiles qui réagissent avec la Thr1 des sous-unités catalytiques en créant un adduit lié par covalence. Il en est de même des candidats thérapeutiques visant l’immunoprotéasome (Figures 8A8C). Or la toxicité des inhibiteurs des protéasomes sera toujours une préoccupation, compte tenu de leur implication dans une très grande variété de fonctions physiologiques. La présence d’une fonction réactive électrophile dans les inhibiteurs covalents est souvent associée à des effets secondaires dus à une réactivité excessive, une instabilité et un manque de sélectivité. En effet, les protéines humaines contiennent de nombreux groupes nucléophiles qui peuvent, par covalence, capturer les groupes électrophiles puissants des inhibiteurs. Au contraire, la fixation non covalente d’un inhibiteur dépourvu de fonction réactive conduit d’une part à une absence de réactions avec des groupes nucléophiles de protéines et d’autre part à des complexes enzyme-inhibiteur de durée de vie limitée favorisant une distribution tissulaire plus large. Les inhibiteurs non covalents du protéasome peuvent donc constituer une alternative aux inhibiteurs covalents. Notre équipe a utilisé deux grandes stratégies pour découvrir des inhibiteurs non covalents originaux : d’une part l’élaboration rationnelle s’inspirant d’inhibiteurs ou de substrats connus de l’enzyme cible, d’autre part des techniques de criblage : criblage virtuel, criblage in vitro ou criblage par cristallographie (Figures 10A10D). L’inhibiteur cyclopeptidique naturel TMC95A issu du champignon ascomycète Apiospora montagnei Sacc. (Koguchi et al., 2000) se lie de manière non covalente et efficace dans le centre actif du protéasome 20S (Groll et al., 2001, 2006a). Sa synthèse complexe en 17 étapes et sa richesse en centres asymétriques étaient défavorables pour une utilisation en thérapeutique. Des mimes cycliques simplifiés, de synthèse moins exigeante, ont été obtenus par l’équipe de Moroder mais restaient peu efficaces (Kaiser et al., 2004 ; Groll et al., 2006a). Nos mimes linéaires basés sur la séquence tripeptidique du TMC95A (Figure 10 Aa) ont conduit à des inhibiteurs non covalents, d’affinité submicromolaire malgré l’absence d’une conformation cyclique entropiquement favorable, et toxiques pour des cellules cancéreuses (Basse et al., 2007 ; Groll et al., 2010). Afin d’augmenter à la fois l’efficacité et la sélectivité pour le protéasome, le principe de multivalence exploité de manière ubiquitaire dans la nature (Mammen et al., 1988) a été utilisé puisque la topographie des six sites actifs du protéasome est unique (Figure 9 Ab). Deux têtes inhibitrices dérivées de nos mimes linéaires non covalents ont été liées par un espaceur de longueur contrôlée pour une fixation optimale dans deux sites actifs sélectionnés (Figure 10 Aa) (Maréchal et al., 2012 ; Desvergne et al., 2013). La co-cristallisation avec le protéasome de levure a démontré que c’est bien la multivalence et non un changement conformationnel qui est responsable de l’augmentation très importante d’affinité (d’un facteur supérieur à 577) par rapport à l’inhibiteur monovalent. Par marquage fluorescent, la pénétration cellulaire des mimes linéaires du TMC95A a été démontrée (Desvergne et al., 2014). Des modifications structurales ultérieures de ces mimes ont conduit à une inhibition d’un, deux ou trois types d’activités de l’immunoprotéasome et un effet cytotoxique sur cellules cancéreuses (Richy et al., 2018). Des pseudopeptides fluorés (Formicola et al., 2009), des α- et β-hydrazino-pseudopeptides (Bordessa et al., 2013) ou des lipopeptides (Basse et al., 2006) ont aussi été élaborés et synthétisés conduisant à d’autres séries d’inhibiteurs non covalents des protéasomes (Figure 10B). Afin de s’affranchir du caractère peptidique des inhibiteurs et ainsi avoir notamment une meilleure stabilité métabolique, des séries d’inhibiteurs organiques de faible poids moléculaire (< 600 Da) ont été identifiés par un criblage combiné in silico et in vitro (Basse et al., 2010) (Figure 10C). Le criblage d’une banque de 430 000 molécules organiques a permis de sélectionner 1167 molécules susceptibles de se fixer dans le site actif de la sous-unité β5 du protéasome de bœuf, dont 65 se sont révélées être des inhibiteurs efficaces du protéasome humain. Les molécules obtenues ont des structures et des propriétés variées pouvant inhiber un seul ou simultanément deux ou trois type(s) d’activités catalytiques. Parmi celles-ci, la série des 1,2,4-oxadiazoles agissant sélectivement sur le protéasome a été optimisée par synthèse chimique et présente une particularité mécanistique nouvelle : l’inhibiteur se fixe exclusivement dans le sous-site S5 de la sous-unité β5 (Maréchal et al., 2013) (Figure 10C). Une sélectivité pour l’immunoprotéasome, confirmée par modélisation moléculaire, a été obtenue pour les sulfonyl pipérazines douées d’une action anti-proliférative de l’invasion tumorale (Villoutreix et al., 2017) (Figure 10C). Un criblage par cristallographie a permis de démontrer une fixation inhabituelle d’un de nos sulfonamides (Figure 10D). Il existe dans cette zone de fixation, située à la jonction des sous-unités β1 (sous-site S4) et β2 (sous-sites S1 et S1’), une grande différence de structure entre cPC et iPC, ce qui constitue une aide structurale pour une évolution vers de nouveaux inhibiteurs sélectifs de l’iPC (Beck et al., 2015). Le criblage cristallographique a l’avantage de pouvoir détecter la fixation de composés même peu affins et ceci dans des régions qui peuvent être totalement inattendues.

D’autres équipes ont aussi développé des inhibiteurs non covalents parmi lesquels on peut citer des dérivés peptidiques (Furet et al., 2004) et organiques comme les hydroxyurées (Gallastegui et al., 2012), ainsi que les dipeptides modifiés synthétisés par les chercheurs de la firme Millenium (découverte du bortezomib). Il s’agit de dipeptides dont les extrémités N- et C-terminales sont bloquées par des groupes chimiques. Sélectionnés par criblage de grandes librairies de dipeptides, ont été obtenus des inhibiteurs distinguant cCP et iCP (Blackburn et al., 2010a, 2010b) ainsi que des inhibiteurs agissant spécifiquement sur le protéasome de Mycobaterium tuberculosis Mtb20S (Lin et al., 2013 ; Zhan et al., 2019). Les différences structurales observées entre les sous-sites S1 et S3 de cCP, iCP et Mtb20S ont été exploitées. Le protéasome Mtb20S est une cible thérapeutique car il joue un rôle très important dans la résistance aux stress oxydatif et nitroso-oxydatif de l’hôte humain. Des 1,3,4-oxathiazole-2-ones (Lin et al., 2009) et des dérivés de syringoline (Totaro et al., 2017), eux aussi sélectifs de Mbt20S, se fixent au contraire par covalence sur la Thr1 des sites actifs.

La grande variété des inhibiteurs connus du protéasome. La liste des inhibiteurs connus du protéasome est excessivement longue comme le montrent les différentes revues citées plus haut. Il ne sera donc pas possible dans cette revue d’être exhaustif. L’extrême diversité structurale des inhibiteurs est à mettre en relation avec la faculté dégradative du protéasome sur une infinité de protéines différentes qui, de plus, se fait au niveau de sites actifs étendus non réellement stringents. Ces sites actifs fournissent une grande palette de possibilités de liaison et aussi de mécanismes, qu’il s’agisse d’inhibiteurs mono- ou bivalents. Ils permettent également d’obtenir une sélectivité d’action entre différents protéasomes et, pour un protéasome donné, entre différents sites actifs. On peut citer quelques exemples. Le criblage in vitro de collections de molécules naturelles ou synthétiques nous a permis d’identifier des inhibiteurs sélectifs de l’immunoprotéasome (piperlongumine et analogues ; Bosc et al., 2018 ; Figure 9E), de la sous-unité β1i (dérivés de bisbenzimidazole ; Koroleva et al., 2015), des sous-unités β1i/β1c ou β5i/βc avec, dans certains cas, des possibilités d’inhibition covalente par des dérivés de cerpégine (Pham et al., 2012 ; Hovhannisyan et al., 2013, 2014 ; Figure 9F). À noter que l’inhibition simultanée de l’activité chymotryptique et de l’activité tryptique ou de l’activité de type caspase augmente l’efficacité inhibitrice du bortezomib ou du carfilzomib dans des cultures de cellules cancéreuses (Britton et al., 2009 ; Mirabella et al., 2011). Cette co-inhibition peut être réalisée en traitant simultanément par deux inhibiteurs spécifiques ou, de manière plus avantageuse, par des inhibiteurs bivalents comme ceux décrits plus haut. L’intérêt de la co-inhibition est aussi démontrée pour l’immunoprotéasome dans le traitement des maladies auto-immunes (Zerfas et al., 2020).

Le protéasome de Plasmodium falciparum a été identifié comme cible valable pour combattre la malaria (Le Chapelain & Groll, 2016). Comme dans le cas de Mycobacterium tuberculosis, la reconnaissance par les sous-sites S1 et S3 est essentielle pour une sélectivité d’action par rapport au protéasome humain. La présence de tryptophane dans la vinylsulfone (vs) WLW-vs assure la sélectivité de l’inhibition de la sous-unité β2 par rapport à la β2 humaine (Li et al., 2014). Un co-traitement WLW-vs/déhydroartémisinine est efficace contre des parasites résistants à l’artémisinine. La vinylsulfone apparentée WLL-vs qui inhibe sélectivement β2/β5 a une fenêtre thérapeutique plus large, inhibant aussi Plasmodium chabaudi (Li et al., 2016). Récemment, un inhibiteur hautement sélectif a été proposé (Zhan et al., 2021).

Freinage ou augmentation de l’activité du protéasome. Au cours du vieillissement, on note une accumulation de protéines endommagées ou mal repliées alors que, en parallèle, l’activité du protéasome diminue. L’accumulation de protéines redondantes est observée dans les neurodégénérescences et dans beaucoup de cancers. L’augmentation de l’activité du protéasome, encore peu explorée, est reconnue comme une nouvelle approche thérapeutique impliquant différents mécanismes (Njomen & Tepe, 2019). On peut jouer sur les modifications post-translationnelles : inhibition de la PDE4 pour augmenter le cAMP, activation de la PKA et de l’activité du protéasome via la phosphorylation de la sous-unité Rpt6. On peut aussi provoquer l’ouverture du pore du 20S par des petites molécules : petits peptides hydrophobes, imidazoline TCH-165 par exemple. Des manipulations génétiques visant à augmenter l’expression des sous-unités du protéasome ont aussi été conduites.

Autres cibles possibles pour une inhibition. Le blocage des récepteurs à l’ubiquitine ainsi que l’inhibition des dé-ubiquitinases Rpn11 et Usp14 peuvent efficacement freiner la dégradation des protéines (Lee et al., 2010, 2016 ; Harrigan et al., 2018) (Figure 11). L’inhibition des DUB se dégage comme une voie thérapeutique émergente de grand intérêt dans beaucoup de pathologies, du cancer à la neurodégénérescence. Il en est de même de l’inhibition des AAA-ATPases, notamment de l’ATPase Rpt6 qui a une structure et un rôle particuliers lors des changements conformationnels.

Le système ubiquitine-protéasome peut avoir une fonction duale dans les pathogenèses virales. Il peut constituer un mécanisme de défense de l’hôte contre l’infection virale, ou, au contraire, être utilisé par les virus pour s’affranchir de ces défenses et augmenter l’infectivité (Luo, 2016). L’élucidation du rôle de ce système dans le cycle cellulaire des coronavirus (Raaben et al., 2010) conduit actuellement à des recherches notamment sur les potentialités des inhibiteurs du protéasome dans une thérapie anti-SARS-CoV-2 visant à réduire l’entrée du virus et l’orage cytokinique (Kircheis et al., 2020a, 2020b ; Longhitano et al., 2020),

Inspiré par les mécanismes des infections virales, le détournement du système UPS par de petites molécules synthétiques pour induire la dégradation sélective par le protéasome d’une protéine donnée est en train de devenir une voie majeure de découverte de nouveaux médicaments (Reboud-Ravaux, 2021).

Tableau 1

Caractéristiques des inhibiteurs de protéasome utilisés en clinique ou en cours d’études cliniques.

thumbnail Figure 9

L’immunoprotéasome et son inhibition. Quand les cellules sont exposées aux cytokines proinflammatoires (INF-γ et TNF-α), la particule catalytique de l’immunoprotéasome est exprimée. Lors des désordres immunitaires, les auto-antigènes activent les cellules T conduisant à l’apoptose. En présence d’un inhibiteur de l’iPC, la production des cytokines est réduite donc aussi l’inflammation locale ce qui permet d’échapper au déclenchement de la réponse immunitaire. Dans le cancer, des inhibiteurs de l’iPC permettraient de contourner les résistances observées avec les inhibiteurs du cPC comme le bortezomib. Le contrôle de l’expression de l’iPC par des inhibiteurs pourrait (encore controversé) participer au contrôle des dommages dus au vieillissement et aux pathologies neurodégénératives.

thumbnail Figure 10

Structures d’inhibiteurs du protéasome constitutif et de l’immunoprotéasome. Aa. Mimes linéaires mono- et bivalents non covalents du TMC95A obtenus par élaboration rationnelle. Ab. Représentation schématique du protéasome 20S de levure montrant la symétrie de l’édifice. Les sous-unités β1, β2 et β5 sont indiquées, ainsi que les distances entre les oxgygènes Oγ des Thr1 catalytiques. B. Hydrazinopseudopeptides et dipeptides modifiés non covalents. C. Inhibiteurs non covalents issus d’un criblage in silico d’une collection de molécules organiques ayant conduit en particulier à la série des 1,2,4-oxadiazoles se fixant exclusivement dans le sous-site S5 du cCP et à celle des sulfonyl pipérazines présentant une préférence pour l’iCP par rapport au cCP. D. Inhibiteur non covalent détecté par criblage cristallographique se fixant de manière originale sur les sous-unités β1 et β2. E. Quelques inhibiteurs covalents. Les références correspondant à ces différentes structures sont indiquées dans le texte.

Conclusion

Le protéasome, machine macromoléculaire de dégradation des protéines, empêche l’accumulation des protéines mal conformées, contrôle le cycle cellulaire et régule la réponse immunitaire, ce qui explique son lien avec des pathologies humaines variées. La caractérisation structurale de ses différentes formes, sa dynamique fonctionnelle et sa régulation demeurent des domaines de recherche très actuels. Les inhibiteurs du protéasome ont conduit à des molécules efficaces dans le traitement des cancers hématologiques en révolutionnant le traitement du myélome multiple et en prolongeant grandement la vie des patients. Ce succès a été facilité par les caractéristiques uniques des cellules plasmatiques transformées. L’extension de l’utilisation des inhibiteurs au traitement de tumeurs solides s’est heurtée à leur toxicité et à l’apparition de résistances sans oublier le passage nécessaire de la barrière hémato-encéphalique pour les cancers cérébraux. Il convient donc de trouver un équilibre entre une inhibition utile et le maintien d’un certain niveau d’activité du protéasome là où elle est nécessaire. Les études fondamentales et cliniques actuelles informent sur les directions à prendre pour élaborer des molécules contournant ces problèmes, compte tenu de la très grande diversité des participants au système ubiquitine-protéasome. La découverte et l’utilisation d’inhibiteurs spécifiques de l’immunoprotéasome modulant la présentation des antigènes devraient être très actives dans le futur. Des inhibiteurs spécifiques du protéasome sont aussi cliniquement nécessaires dans la crise protéotoxique impliquée dans beaucoup de pathologies humaines. Si l’inhibition irréversible de longue durée est une méthode de choix dans certains cas, notamment dans des thérapies anti-parasitaires, une inhibition plus limitée peut être souhaitable. Un large éventail d’inhibiteurs de structures et mécanismes différents (covalents, non covalents) est donc nécessaire afin de privilégier une sélectivité entre espèces de protéasomes et, pour une espèce donnée, entre sous-sites de types catalytiques différents à cibler soit individuellement, soit simultanément, que ce soit par des inhibiteurs mono- ou bifonctionnels (Figure 11).

thumbnail Figure 11

L’inhibition des protéasomes : présent et futur.

Abréviations

AAA-ATPase : ATPase associée à diverses activités cellulaires

AMPc : Adénosine monophosphate cyclique

ATP : Adénosine triphosphate

ATPase : Hydrolase catalysant l’hydrolyse de l’ATP en ADP et phosphate inorganique

ATPγS : Adénosine-5’-O-(3-thio)triphosphate

Bax : Bcl-2-like protein 4

Bcl-2 : B-cell lymphoma 2

Bim : Bcl-2-like protein 11

cPC : Particule catalytique du protéasome constitutif

Cdk : Kinase dépendante de cycline

CMH I : Complexe majeur d’histocompatibilité de classe I

Cryo-EM : Cryo-microscopie électronique

Da : Dalton

DHFR : Dihydrofolate réductase

Drp1 : Dynamin-1-like protein

DUB : Dé-ubiquitinase

DYRK2 : Dual specificity tyrosine-phosphorylation-regulated kinase 2

ERAD : Endoplasmic-reticulum-associated protein degradation

E2F-1 : Target of retinoblastoma protein

FDA : Food and Drug Administration

Fos1 : Facteur de transcription nucléaire

GABA : Acide gamma-aminobutyrique

IC50 : Concentration d’inhibiteur conduisant à 50 % d’inhibition de l’activité catalytique dans des conditions expérimentales données

iPC : Particule catalytique de l’immunoprotéasome

I-κB : Inhibiteur du facteur de transmission NF-κB

IMiD : Immunomodulatory drugs

JNK : c-Jun-amino-terminal kinase

LBVLS : Ligand-based virtual ligand screening

Mfn : Mitofusin

Miro : Mitochondrial Rho GTPase

MoAB : Anticorps monoclonaux

NF-κB : Nuclear factor kappa B

p21 : Cyclin-dependent inhibitor 1

p27 : Inhibiteur de kinase dépendant de la cycline

p53 : Tumor protein 53 (tumor suppressor)

PC : Particule catalytique

PDE4 : Phosphodiestérase de type 4

PKA : Protéine kinase A

PR : Particule régulatrice

PSD-95 : Postsynaptic density protein 95

RE : Réticulum endoplasmique

Rpn : Regulatory particle non-ATPase protein

Rpt : Regulatory particle triple A protein (ATPase)

SARS-CoV-2 : Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2

SBVL : Structure-based virtual ligand screening

SUP : Système ubiquitine protéasome

TNF-α : Facteur de nécrose tumorale α

Topo II : Topoisomérase de type II

TORC1 : Target of rapamycin (TOR) complex 1

TPPII : Tripeptidyl peptidase II

UCH : Ubiquitin carboxy terminal hydrolase

Wnt : Wingless-type

Remerciements

Je remercie Madame Sophie Gournet (Plate-forme Illustration & Graphisme ; IBPS, Sorbonne Université) qui a réalisé la représentation graphique de tous les édifices moléculaires des protéasomes.

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Citation de l’article : Reboud-Ravaux, M. (2021). Le protéasome, la seconde vie d’une cible thérapeutique validée : aspects structuraux et nouveaux inhibiteurs. Biologie Aujourd’hui, 215, 1-23

Liste des tableaux

Tableau 1

Caractéristiques des inhibiteurs de protéasome utilisés en clinique ou en cours d’études cliniques.

Liste des figures

thumbnail Figure 1

Schématisation de la dégradation des protéines par les protéasomes 26S, 20S et l’immunoprotéasome. Le système ubquitine-protéasome (SUP) nécessite une action hautement coordonnée de ses composants lors de l’ubiquitinylation des protéines à dégrader, de la dé-ubiquitinylation et de la dégradation des protéines. La chaîne de poly-ubiquitine est liée via la lysine 48. La dégradation des protéines se fait sans ubiquitinylation préalable lorsqu’elle est catalysée par le protéasome 20S, l’immunoprotéasome et, dans certains cas, par le protéasome 26S.

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thumbnail Figure 2

Résumé des multiples rôles physiologiques ou physiopathologiques joués par les protéasomes. Des exemples de substrats protéiques impliqués sont indiqués.

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thumbnail Figure 3

Les protéasomes 20S des grands domaines du vivant. A noter l’analogie existant en termes de taille, forme, composition en polypeptides et activités protéolytiques. Les sept sous-unités α constituant chaque anneau α sont représentées en gris foncé sauf la sous-unité α4s typique du spermatoprotéasome qui est colorée en violet. Les sous-unités β porteuses d’un site actif sont colorées.

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thumbnail Figure 4

Composition du protéasome 20S eucaryote constitutif. Coupe et agencement des sous-unités α et β⋅ Les sous-unités β comportant un site actif sont colorées en fonction de leur spécificité établie vis-à-vis des petits substrats synthétiques peptidiques. Les sites actifs sont localisés dans la chambre catalytique, elle-même entourée de deux chambres antérieures où les substrats peptidiques peuvent être stockés. La position du pore devant s’ouvrir lors de la translocation des substrats est indiquée. amc : 7-amino-4-méthyl-coumarine ; βNA, β-naphtylamine.

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Structure et fonctionnement du protéasome 26S. A. Schématisation de la particule 19S associée au protéasome 20S et formée de deux sous-complexes : le couvercle (Rpn 3, 5–9, 11, 12, 15) et la base (Rpt 1–6 {ATPases} et Rpn1, 2 et 13). Sont indiquées les sous-unités ayant une fonction particulière. En rose foncé, les sous-unités Rpn1, 10 et 13 capables de fixer la chaîne d’ubiquitine ; en orange, la dé-ubiquitinase Rpn11 (métalloprotéase) ; en rose clair, la dé-ubiquitinase Usp14 (cystéine protéase) nommée Ubp6 chez Saccharomyces cerevisiae. L’anneau formé par les 6 ATPases est coloré en bleu turquoise. B. Fonctionnement schématisé du protéasome 26S. Le substrat (en jaune) porteur d’une chaîne de poly-ubiquitine (en violet) est déplié à la suite des changements conformationnels coordonnés des ATPases et des sous-unités α. Les sites actifs des six sous-unités catalytiques sont représentés par des pastilles rouges. La chaîne protéique dépliée est alors injectée dans la chambre catalytique du 20S où elle subit une dégradation itérative. C. Schématisation du pore fermé du 20S (avant la complexation avec la particule régulatrice 19S) et du pore ouvert (après complexation). Avant complexation, les extrémités N-terminales des sous-unités α2, α3 et α4 obstruent le pore. Les changements conformationnels induits par le fonctionnement des six ATPases situées en regard des sous-unités α conduisent à une interaction entre les extrémités C-terminales des ATPases Rpt1et Rpt6 et les sous-unités de l’anneau α déclenchant l’ouverture du pore.

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thumbnail Figure 6

Edifices moléculaires de protéasomes. A. Schématisation de la structure d’un protéasome 20S associé à des particules régulatrices PA28 (11S), 19S ou PA200. B. Les différentes associations 20S-particules régulatrices trouvées en milieu cellulaire.

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thumbnail Figure 7

Hydrolyse des protéines catalysée par le protéasome. A. Mécanisme proposé pour l’hydrolyse des liaisons peptidiques des protéines. La thréonine catalytique Thr1 est représentée en bleu. Un premier intermédiaire tétraédrique IT1 est formé après l’attaque du carbonyle de la liaison scissile par la fonction hydroxyle de la Thr1 ce qui conduit à la formation d’une acyl-enzyme. Un deuxième intermédiaire tétraédrique IT2 résulte de l’attaque du carbonyle de l’acyl-enzyme par une molécule d’eau. Ces deux intermédiaires chargés négativement sont stabilisés via la formation d’une liaison hydrogène entre leur oxygène chargé négativement et le groupe NH de la Gly47 dans le trou oxyanion. B. Représentation schématisée selon Schechter & Berger (1967) de la crevasse du site actif d’un protéasome accommodant la séquence d’une protéine en vue de son hydrolyse. La Thr1 est indiquée ainsi que la liaison sécable. Les acides aminés sont représentés par des rectangles et leurs chaînes latérales sont numérotées respectivement P1-Pn et P1’et Pn’ selon que les acides aminés sont en amont ou en aval de la liaison sécable. Les chaînes latérales sont reconnues respectivement par les sous-sites de spécificité S1-Sn et S1’-Sn’. Le sous-site S4 de l’iPC présente une cystéine en position 48. Les sous-sites accommodant les chaînes latérales des acides aminés sont représentés par des croissants gris.

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thumbnail Figure 8

Structure chimique des inhibiteurs du protéasome constitutif et de l’immunoprotéasome utilisés en clinique ou en préclinique et leur mécanisme d’action. A. Inhibiteurs du protéasome constitutif : bortezomib, carfilzomib et ixazomib sont utilisés en clinique. Les modes d’administration sont intraveineux (pour le carfilzomib, Kyprolis®, Proteolyx Inc.), ou, préférentiellement, sous-cutané (pour le bortezomib, Velcade®, Millenium Pharmaceuticals) ou per os (pour la prodrogue MNL2238 qui, par hydrolyse, libérera l’ixazomib, Ninlaro®, Takeda). Le marizomib et l’oprozomib sont des molécules en étude clinique développées respectivement par Nereus et ONYX Pharmaceuticals. Les sous-sites de sélectivité liant les inhibiteurs sont indiqués. Les boronates conduisent à des inhibitions lentement réversibles alors que les époxycétones et le marizomib entraînent des inhibitions irréversibles. Les époxycétones conduisent à un adduit hexagonal 1,4-morpholine avec le protéasome de levure tandis qu’un adduit cyclique heptagonal 1,4-oxazepane a été mis en évidence avec le protéasome 20S humain. B. Mécanismes d’action sur les protéasomes des boronates (bortezomib, ixazomib), des époxycétones (carfilzomib, oprozomib, ONX-0914 et KZR-616) et du marizomib. C. Inhibiteurs actuellement en étude clinique et agissant sélectivement sur l’immunoprotéasome.

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thumbnail Figure 9

L’immunoprotéasome et son inhibition. Quand les cellules sont exposées aux cytokines proinflammatoires (INF-γ et TNF-α), la particule catalytique de l’immunoprotéasome est exprimée. Lors des désordres immunitaires, les auto-antigènes activent les cellules T conduisant à l’apoptose. En présence d’un inhibiteur de l’iPC, la production des cytokines est réduite donc aussi l’inflammation locale ce qui permet d’échapper au déclenchement de la réponse immunitaire. Dans le cancer, des inhibiteurs de l’iPC permettraient de contourner les résistances observées avec les inhibiteurs du cPC comme le bortezomib. Le contrôle de l’expression de l’iPC par des inhibiteurs pourrait (encore controversé) participer au contrôle des dommages dus au vieillissement et aux pathologies neurodégénératives.

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thumbnail Figure 10

Structures d’inhibiteurs du protéasome constitutif et de l’immunoprotéasome. Aa. Mimes linéaires mono- et bivalents non covalents du TMC95A obtenus par élaboration rationnelle. Ab. Représentation schématique du protéasome 20S de levure montrant la symétrie de l’édifice. Les sous-unités β1, β2 et β5 sont indiquées, ainsi que les distances entre les oxgygènes Oγ des Thr1 catalytiques. B. Hydrazinopseudopeptides et dipeptides modifiés non covalents. C. Inhibiteurs non covalents issus d’un criblage in silico d’une collection de molécules organiques ayant conduit en particulier à la série des 1,2,4-oxadiazoles se fixant exclusivement dans le sous-site S5 du cCP et à celle des sulfonyl pipérazines présentant une préférence pour l’iCP par rapport au cCP. D. Inhibiteur non covalent détecté par criblage cristallographique se fixant de manière originale sur les sous-unités β1 et β2. E. Quelques inhibiteurs covalents. Les références correspondant à ces différentes structures sont indiquées dans le texte.

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thumbnail Figure 11

L’inhibition des protéasomes : présent et futur.

Dans le texte

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